T-UCR表达筛选与临床样本验证
鉴定在结直肠癌中差异表达的T-UCR，并验证候选T-UCR在临床样本中的表达。
对150对CRC和癌旁组织的混合RNA进行T-UCR微阵列分析，筛选差异表达T-UCR；在82对和61对CRC及癌旁组织样本中通过qPCR验证uc.285+表达，并进行ROC曲线和生存分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
转录的超保守非编码RNA uc.285+通过直接结合mRNA和蛋白质双重靶向CDC42促进结直肠癌增殖
A transcribed ultraconserved noncoding RNA, uc.285+, promotes colorectal cancer proliferation through dual targeting of CDC42 by directly binding mRNA and protein
实验完整度
高包含体外细胞功能实验（增殖、凋亡、迁移、周期）、体内裸鼠移植瘤模型、以及机制验证（RAP、RNA pulldown、RIP、双荧光素酶、mRNA和蛋白稳定性），证据层级独立且完整。
主要模型
结直肠癌细胞系（SW480、HT29、HCT116） 正常结直肠上皮细胞FHC 裸鼠皮下移植瘤模型 结直肠癌患者组织样本
重点核对
T-UCR微阵列筛选及uc.285+在CRC组织中的差异表达验证 siRNA沉默和过表达uc.285+后CRC细胞增殖、凋亡、迁移和周期变化 裸鼠皮下移植瘤模型中uc.285+敲低对肿瘤生长的影响 uc.285+与CDC42 mRNA直接结合的验证（RAP、双荧光素酶报告基因） uc.285+与CDC42蛋白直接结合的验证（RNA pulldown、RIP）
摘要
转录的超保守区域（T-UCR）属于新型lncRNA，在大鼠、小鼠和人类基因组的同源区域中保守。大量研究报道T-UCR的差异表达可影响各种癌症的发展，揭示了T-UCR作为新治疗靶点或潜在癌症生物标志物的能力。大多数关于T-UCR在癌症中分子机制的研究集中于ceRNA调控网络和与靶蛋白的相互作用，但本研究揭示了一种创新的双重靶向调控方法，其中T-UCR直接结合mRNA和直接结合蛋白质。我们通过进行全基因组T-UCR基因微阵列筛选了可能与结直肠癌（CRC）相关的T-UCR，并进一步研究了T-UCR uc.285+在CRC发展中的功能机制。调节uc.285+影响CRC细胞系的增殖并影响CDC42基因的表达。我们还发现uc.285+通过直接结合CDC42 mRNA并增强其稳定性，同时直接结合CDC42蛋白并影响其稳定性，从而促进CRC细胞的增殖。总之，我们对细胞增殖特征的研究发现，uc.285+具有促进CRC增殖的生物学功能。uc.285+可能具有作为CRC新诊断生物标志物的巨大潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- T-UCR uc.285+在结直肠癌发展中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- uc.285+通过直接结合CDC42 mRNA增强其稳定性，并直接结合CDC42蛋白影响其稳定性，从而上调CDC42蛋白表达，加速G0/G1期进程，最终促进结直肠癌细胞增殖。
- 主要证据
- T-UCR微阵列和qPCR显示uc.285+在CRC组织和细胞中高表达；体外功能实验和体内移植瘤模型证实uc.285+促进增殖；RAP、双荧光素酶、RNA pulldown和RIP实验证实uc.285+直接结合CDC42 mRNA和蛋白，并影响其稳定性。
- 研究意义
- uc.285+可能作为结直肠癌的新型诊断生物标志物，并可能成为结直肠癌的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞功能实验
评估uc.285+对结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移和周期的影响。
在SW480、HT29和HCT116细胞中瞬时转染uc.285+ siRNA或过表达质粒，通过CCK-8、EdU、ATP实验检测增殖，流式细胞术检测凋亡和周期，Transwell和细胞划痕实验检测迁移。
体内移植瘤模型验证
验证uc.285+在体内对结直肠癌细胞增殖的影响。
构建SW480稳定敲低uc.285+的细胞系，皮下注射至裸鼠，5周后处死并测量肿瘤大小和重量。
机制验证：uc.285+与CDC42 mRNA直接结合
验证uc.285+是否直接结合CDC42 mRNA并影响其稳定性。
通过RAP实验验证uc.285+与CDC42 mRNA的直接结合；通过双荧光素酶报告基因验证结合位点；通过ActD处理检测mRNA稳定性。
机制验证：uc.285+与CDC42蛋白直接结合
验证uc.285+是否直接结合CDC42蛋白并影响其稳定性。
通过RNA pulldown和质谱分析鉴定uc.285+结合蛋白；通过RIP实验验证uc.285+与CDC42蛋白的直接结合；通过CHX处理检测蛋白稳定性。
功能恢复实验
验证CDC42过表达是否能逆转uc.285+沉默引起的细胞增殖抑制和周期阻滞。
在稳定或瞬时沉默uc.285+的SW480和HT29细胞中过表达CDC42，通过CCK-8、EdU和流式细胞术检测细胞活力和周期变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂 | Dojindo | CK04 |
| EdU检测试剂盒 | Ruibo | C10310 | |
| 细胞活性检测 | Cell Titer-Glo 2.0 细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 凋亡检测 | FITC凋亡检测试剂盒 | KGI | KGA107 |
| 细胞周期检测 | 流式细胞周期检测试剂盒 | KGI | KGA511 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 |
| 反转录 | 反转录试剂盒 | Promega | A6001 |
| qPCR | GoTaq® qPCR试剂盒 | Promega | A6002 |
| 机制验证 | RNA反义纯化试剂盒 | BersinBio | Bes5103-3 |
| RNA pull-down试剂盒 | BersinBio | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1901 | |
| 蛋白检测 | CDC42抗体 | Cell Signaling Technology | 2462 |
| CDC42抗体 | Signalway Antibody | 49282 | |
| Tubulin抗体 | Abway | AB0012 | |
| Tubulin抗体 | Servicebio | GB11017 | |
| 增强化学荧光底物 | GE Healthcare | RPN5787 | |
| Typhoon FLA 7000成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| Clinx S6系统 | Clinx | -- | |
| 细胞转染 | riboFECT CP转染试剂盒 | Ruibo | C105511 |
| 质粒提取 | 质粒提取试剂盒 | QIAGEN | 12145 |
| 细胞培养 | DMEM:F12培养基 | ATCC | 30-2006 |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | 61870036 | |
| M5a培养基 | Gibco | 16600082 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 1750114 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Servicebio | G4003 | |
| 蛋白质消化 | 蛋白酶K | Sangon Biotech | -- |
| 核酸染色 | 绿色荧光核酸染料 | Solarbio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| T-UCR表达筛选与临床样本验证 | T-UCR微阵列的样本来源和平台；uc.285+ qPCR验证的组织样本配对数量和来源；ROC曲线和生存分析的统计方法 阅读提示：Materials and Methods: Tissue specimens and T-UCR microarray; Results 第一部分; Figure 1 legend |
| 体外细胞功能实验 | 细胞系和培养条件；siRNA和过表达质粒的转染浓度和效率；CCK-8、EdU、ATP、流式、Transwell和划痕实验的具体参数（细胞密度、孵育时间、染料浓度） 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture, Plasmids and primers, Silencing of uc.285+ and transfections, Cell proliferation assay, Flow cytometric CRC cell cycle and apoptosis analysis, Cell migration assay; Results 第二部分; Figure 2 legend |
| 体内移植瘤模型验证 | 动物品系、周龄、性别和饲养条件；细胞注射数量和部位；肿瘤测量和处死时间 阅读提示：Materials and Methods: Laboratory animals, Colorectal cancer xenografts; Results 第三部分; Figure 3 legend |
| 机制验证：uc.285+与CDC42 mRNA直接结合 | RAP实验的细胞数量和交联条件；双荧光素酶报告基因的质粒构建和转染方法；mRNA稳定性实验的ActD浓度和时间点 阅读提示：Materials and Methods: RNA antisense purification, Dual luciferase reporter assay, mRNA stability test; Results 第四部分; Figure 4 legend |
| 机制验证：uc.285+与CDC42蛋白直接结合 | RNA pulldown实验的细胞数量和裂解条件；RIP实验的抗体用量和缓冲液条件；蛋白稳定性实验的CHX浓度和时间点 阅读提示：Materials and Methods: RNA pulldown, RNA immunoprecipitation, Protein stability test; Results 第五部分; Figure 5 legend |