猪胆酸类物质作为低出生体重仔猪盲肠上皮稳态的关键调节因子

Hyocholic Acid Species as the Key Modulator for Cecal Epithelial Homeostasis in Low-Birth-Weight Piglets

作者信息Chang Yin, Xuan Liu, Wei Fang, Qingshi Meng, Xiaohui Feng, Weidong Zhang, Guoqi Dang, Ruqing Zhong, Liang Chen, Zirong Wang, Hongfu Zhang
PMID41228488
期刊Nutrients
发布时间2025-10-30
DOI10.3390/nu17213415

实验完整度

包含体内动物模型(LBW与NBW仔猪)、组织学分析、16S rRNA测序、RNA-seq、Western blot和免疫荧光等多层级验证,并进行了功能验证和机制探讨。

主要模型

LBW仔猪模型(Duroc×Landrace×Large White) NBW仔猪模型(Duroc×Landrace×Large White)

重点核对

LBW与NBW仔猪的配对选择标准(初始体重比<70%) 胆汁粉剂量(25 mg/kg BW,口服灌胃,14天) 盲肠形态学测量(盲肠长度、黏膜厚度) 肠道微生物失调指数(MDI)的计算 关键蛋白表达(WNT8B、GPBAR1、FXR、Occludin、Claudin-1、ZO-1、MUC2)

摘要

背景:低出生体重(LBW)与肠道菌群失调和肠道屏障功能破坏相关,增加对肠道疾病的易感性。这些改变强调了识别肠道稳态关键调节因子的迫切需要,其中胆汁酸越来越被认为对屏障完整性、微生物生态和宿主代谢至关重要。方法:比较了八对LBW(初始体重为0.850±0.053 kg)和正常出生体重(NBW;1.488±0.083 kg)仔猪,以评估盲肠形态和胆汁酸谱。随后,将十六头LBW仔猪和八头NBW仔猪分为三组:NBW(1.563±0.052 kg)、LBW对照组(LBW-CON;0.950±0.120 kg)和LBW加胆汁酸补充组(LBW-胆汁粉;0.925±0.116 kg)。LBW-胆汁粉组的仔猪每天口服灌胃25 mg/kg BW的胆汁粉(富含猪去氧胆酸),持续14天。结果:LBW仔猪表现出盲肠发育迟缓和猪胆酸类物质丰度降低(p=0.006)。重要的是,与LBW-CON仔猪相比,胆汁粉补充显著改善了盲肠长度(p=0.009)和黏膜厚度(p=0.020)。微生物分析显示,微生物失调指数恢复到接近正常水平。转录组分析显示LBW仔猪的细胞外基质结构和黏液分泌受损。值得注意的是,胆汁粉补充显著上调了WNT8B(p<0.001)和胆汁酸受体(即GPBAR1和FXR)的蛋白表达,同时增强了紧密连接和杯状细胞标志物黏蛋白-2的表达(p<0.05)。结论:这些发现表明,特定胆汁酸补充改善了LBW仔猪的肠道屏障功能,并部分支持盲肠发育。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
低出生体重仔猪盲肠中猪胆酸类物质(HCAs)的减少是否与盲肠发育和屏障功能受损相关,以及补充HCAs能否改善这些异常?
核心机制
HCAs通过上调胆汁酸受体GPBAR1和FXR,激活WNT8B信号通路,增强紧密连接蛋白(Occludin、Claudin-1、ZO-1)和黏蛋白MUC2的表达,从而改善肠道屏障功能。
主要证据
基于LBW与NBW仔猪的对比和胆汁粉补充实验,通过组织学、16S rRNA测序、RNA-seq、Western blot和免疫荧光等方法,观察到HCAs补充恢复盲肠形态、微生物失调指数和屏障蛋白表达。
研究意义
该研究提示,靶向胆汁酸恢复可作为改善低出生体重新生儿肠道功能障碍的营养策略。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立LBW与NBW仔猪模型

比较低出生体重与正常出生体重仔猪在盲肠形态和胆汁酸谱方面的差异。

从每窝中选择LBW(初始体重<NBW的70%)和NBW仔猪各一头,在第7天处死,收集盲肠组织和内容物进行组织学和胆汁酸分析。

2

胆汁粉补充实验

评估口服补充猪胆酸类物质(HCAs)对LBW仔猪盲肠发育和屏障功能的影响。

LBW仔猪随机分为LBW-CON和LBW-胆汁粉组,后者每天口服灌胃25 mg/kg BW的胆汁粉(富含HDCA),持续14天;NBW组作为对照。实验结束后收集盲肠组织进行后续分析。

3

盲肠组织学分析

评估盲肠形态学变化,包括长度、黏膜厚度等。

采用H&E染色对盲肠组织切片进行形态学分析,使用ImageJ测量黏膜厚度、盲肠长度等指标。

4

盲肠内容物胆汁酸谱分析

定量检测盲肠内容物中各类胆汁酸浓度,特别是HCAs的变化。

通过LC-MS/MS对盲肠内容物进行胆汁酸谱分析,包括HCA、HDCA、初级胆汁酸和次级胆汁酸等。

5

肠道微生物组分析

比较各组间盲肠黏膜微生物群落的多样性和组成,评估HCAs对菌群失调的影响。

提取盲肠内容物DNA,扩增16S rRNA V3-V4区域,进行Illumina测序,使用QIIME等流程分析α多样性、β多样性和差异微生物。

6

转录组测序分析

分析LBW和HCAs补充对盲肠黏膜基因表达谱的影响,以揭示潜在机制。

提取盲肠黏膜RNA,构建文库并进行RNA-seq,使用HISAT2比对到猪参考基因组,DESeq2鉴定差异表达基因,并进行KEGG富集分析。

7

蛋白质表达验证

验证HCAs对胆汁酸受体、紧密连接蛋白和炎症相关蛋白表达的影响。

使用Western blot检测GPBAR1、FXR、Occludin、Claudin-1、Claudin-4、ZO-1、WNT8B、IL-1β、STAT4等蛋白的表达,并通过免疫荧光检测MUC2的表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
猪胆汁提取物(富含猪胆酸类物质的粉末)----
总胆汁酸测定试剂盒Jiancheng Bioengineering Institute--
徕卡DM2000光学显微镜Leica Microsystems--
总RNA提取试剂盒Gene BetterR013-50
High-Capacity cDNA Archive试剂盒Takara--
ABI 7900-HT实时荧光定量PCR仪Applied Biosciences--
Qiagen DNA提取试剂盒Qiagen--
TRIzol试剂Invitrogen--
Qubit 4.0荧光计Life Technologies--
Illumina NovaSeq X Plus测序平台Illumina--
安捷伦6890N气相色谱仪Agilent Technologies--
Bond Elut C18固相萃取柱Agilent Technologies--
沃特世ACQUITY UPLC系统Waters--
沃特世Xevo TQ-S质谱仪Waters--
GPBAR1抗体ABclonalA25850
FXR抗体Biossbs-12867R
Occludin抗体AffinityDF7504
ZO-1抗体Proteintech21773-1-AP
Claudin-1抗体AffinityDF6919
Claudin-4抗体AffinityDF5350
WNT8B抗体AffinityDF2441
IL-1β抗体Biossbs-0812R
STAT-4抗体AffinityAF6441
β-肌动蛋白抗体Sangon BiotechD110001
二抗Sangon BiotechD110058
MUC2抗体ABclonalAB4767
二抗BeyotimeA0516

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
猪品种(Duroc×Landrace×Large White)、LBW定义(初始体重<NBW的70%)、出生日龄、窝内配对
阅读提示:Methods 2.1节
胆汁粉补充
胆汁粉来源和成分(主要含HDCA)、剂量(25 mg/kg BW)、给药方式(口服灌胃)、频率(每日一次)、持续时间(14天)
阅读提示:Methods 2.1节
组织学分析
盲肠采样位置、固定方法(4%多聚甲醛)、切片厚度(5 μm)、染色方法(H&E)、测量指标(黏膜厚度、盲肠长度)
阅读提示:Methods 2.3节
胆汁酸谱分析
盲肠内容物处理方法、LC-MS/MS参数(如色谱柱、流动相)以及各胆汁酸标准品和内标
阅读提示:Methods 2.7节
微生物组分析
DNA提取试剂盒、16S rRNA高变区(V3-V4)、引物序列(338F/806R)、测序平台、OTU聚类阈值(97%)、MDI计算方式
阅读提示:Methods 2.5节
RNA-seq分析
RNA提取方法、文库构建试剂盒、测序平台、差异基因筛选阈值(p<0.05且|log2FC|>0.263)
阅读提示:Methods 2.6节
蛋白表达分析
一抗来源、稀释度、二抗来源、蛋白上样量、内参选择(β-Actin)
阅读提示:Methods 2.8节