建立LBW与NBW仔猪模型
比较低出生体重与正常出生体重仔猪在盲肠形态和胆汁酸谱方面的差异。
从每窝中选择LBW(初始体重<NBW的70%)和NBW仔猪各一头,在第7天处死,收集盲肠组织和内容物进行组织学和胆汁酸分析。
Hyocholic Acid Species as the Key Modulator for Cecal Epithelial Homeostasis in Low-Birth-Weight Piglets
包含体内动物模型(LBW与NBW仔猪)、组织学分析、16S rRNA测序、RNA-seq、Western blot和免疫荧光等多层级验证,并进行了功能验证和机制探讨。
LBW仔猪模型(Duroc×Landrace×Large White) NBW仔猪模型(Duroc×Landrace×Large White)
LBW与NBW仔猪的配对选择标准(初始体重比<70%) 胆汁粉剂量(25 mg/kg BW,口服灌胃,14天) 盲肠形态学测量(盲肠长度、黏膜厚度) 肠道微生物失调指数(MDI)的计算 关键蛋白表达(WNT8B、GPBAR1、FXR、Occludin、Claudin-1、ZO-1、MUC2)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较低出生体重与正常出生体重仔猪在盲肠形态和胆汁酸谱方面的差异。
从每窝中选择LBW(初始体重<NBW的70%)和NBW仔猪各一头,在第7天处死,收集盲肠组织和内容物进行组织学和胆汁酸分析。
评估口服补充猪胆酸类物质(HCAs)对LBW仔猪盲肠发育和屏障功能的影响。
LBW仔猪随机分为LBW-CON和LBW-胆汁粉组,后者每天口服灌胃25 mg/kg BW的胆汁粉(富含HDCA),持续14天;NBW组作为对照。实验结束后收集盲肠组织进行后续分析。
评估盲肠形态学变化,包括长度、黏膜厚度等。
采用H&E染色对盲肠组织切片进行形态学分析,使用ImageJ测量黏膜厚度、盲肠长度等指标。
定量检测盲肠内容物中各类胆汁酸浓度,特别是HCAs的变化。
通过LC-MS/MS对盲肠内容物进行胆汁酸谱分析,包括HCA、HDCA、初级胆汁酸和次级胆汁酸等。
比较各组间盲肠黏膜微生物群落的多样性和组成,评估HCAs对菌群失调的影响。
提取盲肠内容物DNA,扩增16S rRNA V3-V4区域,进行Illumina测序,使用QIIME等流程分析α多样性、β多样性和差异微生物。
分析LBW和HCAs补充对盲肠黏膜基因表达谱的影响,以揭示潜在机制。
提取盲肠黏膜RNA,构建文库并进行RNA-seq,使用HISAT2比对到猪参考基因组,DESeq2鉴定差异表达基因,并进行KEGG富集分析。
验证HCAs对胆汁酸受体、紧密连接蛋白和炎症相关蛋白表达的影响。
使用Western blot检测GPBAR1、FXR、Occludin、Claudin-1、Claudin-4、ZO-1、WNT8B、IL-1β、STAT4等蛋白的表达,并通过免疫荧光检测MUC2的表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 胆汁酸补充 | 猪胆汁提取物(富含猪胆酸类物质的粉末) | -- | -- |
| 总胆汁酸测定 | 总胆汁酸测定试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| 组织学分析 | 徕卡DM2000光学显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| RT-qPCR | 总RNA提取试剂盒 | Gene Better | R013-50 |
| High-Capacity cDNA Archive试剂盒 | Takara | -- | |
| ABI 7900-HT实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosciences | -- | |
| 16S rRNA基因测序 | Qiagen DNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Qubit 4.0荧光计 | Life Technologies | -- | |
| Illumina NovaSeq X Plus测序平台 | Illumina | -- | |
| GC-MS | 安捷伦6890N气相色谱仪 | Agilent Technologies | -- |
| 胆汁酸分析 | Bond Elut C18固相萃取柱 | Agilent Technologies | -- |
| 沃特世ACQUITY UPLC系统 | Waters | -- | |
| 沃特世Xevo TQ-S质谱仪 | Waters | -- | |
| Western blot | GPBAR1抗体 | ABclonal | A25850 |
| FXR抗体 | Bioss | bs-12867R | |
| Occludin抗体 | Affinity | DF7504 | |
| ZO-1抗体 | Proteintech | 21773-1-AP | |
| Claudin-1抗体 | Affinity | DF6919 | |
| Claudin-4抗体 | Affinity | DF5350 | |
| WNT8B抗体 | Affinity | DF2441 | |
| IL-1β抗体 | Bioss | bs-0812R | |
| STAT-4抗体 | Affinity | AF6441 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Sangon Biotech | D110001 | |
| 二抗 | Sangon Biotech | D110058 | |
| 免疫荧光 | MUC2抗体 | ABclonal | AB4767 |
| 二抗 | Beyotime | A0516 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 猪品种(Duroc×Landrace×Large White)、LBW定义(初始体重<NBW的70%)、出生日龄、窝内配对 阅读提示:Methods 2.1节 |
| 胆汁粉补充 | 胆汁粉来源和成分(主要含HDCA)、剂量(25 mg/kg BW)、给药方式(口服灌胃)、频率(每日一次)、持续时间(14天) 阅读提示:Methods 2.1节 |
| 组织学分析 | 盲肠采样位置、固定方法(4%多聚甲醛)、切片厚度(5 μm)、染色方法(H&E)、测量指标(黏膜厚度、盲肠长度) 阅读提示:Methods 2.3节 |
| 胆汁酸谱分析 | 盲肠内容物处理方法、LC-MS/MS参数(如色谱柱、流动相)以及各胆汁酸标准品和内标 阅读提示:Methods 2.7节 |
| 微生物组分析 | DNA提取试剂盒、16S rRNA高变区(V3-V4)、引物序列(338F/806R)、测序平台、OTU聚类阈值(97%)、MDI计算方式 阅读提示:Methods 2.5节 |
| RNA-seq分析 | RNA提取方法、文库构建试剂盒、测序平台、差异基因筛选阈值(p<0.05且|log2FC|>0.263) 阅读提示:Methods 2.6节 |
| 蛋白表达分析 | 一抗来源、稀释度、二抗来源、蛋白上样量、内参选择(β-Actin) 阅读提示:Methods 2.8节 |