鉴定circABCA1及其在ccRCC中的表达特征
筛选并验证参与ccRCC脂质代谢的circRNA，确定circABCA1的环状结构和表达上调。
通过ceRNA微阵列筛选差异表达的circRNA，结合GO分析挑选脂质代谢相关候选，聚焦circABCA1。使用RT-qPCR、RNase R处理、放线菌素D处理、亚细胞分级和FISH验证其环状结构、稳定性和细胞质定位。
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CircABCA1通过IGF2BP3介导的SCARB1 mRNA稳定性调控胆固醇代谢并促进M2巨噬细胞极化，从而促进透明细胞肾细胞癌进展
CircABCA1 promotes ccRCC by reprogramming cholesterol metabolism and facilitating M2 macrophage polarization through IGF2BP3-mediated stabilization of SCARB1 mRNA
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、体内异种移植和肝转移模型、临床样本分析及机制验证（RIP、RNA pull-down、双荧光素酶、脂筏、脂自噬和巨噬细胞共培养）等多层级证据。
主要模型
Caki-1细胞系 786-O细胞系 THP-1诱导的M2巨噬细胞 皮下异种移植瘤小鼠模型 肝转移小鼠模型
重点核对
circABCA1表达水平与ccRCC分期及转移的相关性 SCARB1 siRNA和circABCA1 siRNA的敲低效率 circABCA1-IGF2BP3-SCARB1 mRNA三元复合物的形成及对SCARB1 mRNA稳定性的影响 胆固醇摄取和流出实验的条件（如DiI-HDL浓度和孵育时间） 体内实验中si-circABCA1的给药剂量和时间
摘要
背景：透明细胞肾细胞癌(ccRCC)对外源性胆固醇输入的依赖性暗示了一种代谢易感性。这种易感性代表了一个可利用的潜在途径，可作为ccRCC的新治疗策略。环状RNA(circRNA)是癌症中新兴的调控因子，但它们在ccRCC脂质代谢和肿瘤微环境重塑中的作用仍不清楚。本研究探讨circABCA1在ccRCC胆固醇稳态和M2巨噬细胞极化中的促肿瘤作用。方法：采用RT-qPCR和western blot检测circABCA1、IGF2BP3、SCARB1、自噬相关蛋白以及IGF1R/PI3K/AKT/mTOR和ABCA1/ABCG1通路的表达水平。采用非靶向代谢组学、RNA测序和MS2 RNA pull-down鉴定靶标。相互作用分析包括RNA免疫沉淀、RNA pull-down和RNA荧光原位杂交(FISH)实验。进行了脂筏测量、胆固醇摄取/流出实验和脂自噬评估。建立了M2巨噬细胞与ccRCC细胞共培养体系。通过异种移植模型和肝转移模型评估体内肿瘤发生和转移。统计分析采用Student's t检验和ANOVA；显著性水平设为P<0.05。结果：我们鉴定了一个新的脂质代谢相关circRNA，circABCA1，它在ccRCC中上调，并与肿瘤分期和远处转移正相关。在功能上，circABCA1通过形成circABCA1-IGF2BP3-SCARB1 mRNA三元复合物增强SCARB1 mRNA的半衰期，从而增加SCARB1的表达和随后的胆固醇摄取。接下来，由circABCA1-SCARB1轴引起的高胆固醇维持了脂筏，启动了IGF1R/PI3K/AKT/mTOR级联反应，并保护脂滴免于被脂自噬破坏，导致胆固醇流出减少。CircABCA1以SCARB1依赖的方式促进ccRCC的体内外增殖和迁移。此外，我们发现circABCA1通过以SCARB1依赖的方式促进ccRCC从肿瘤微环境中摄取胆固醇，从而促进M2巨噬细胞极化和随后的促肿瘤效应。结论：CircABCA1通过调节胆固醇代谢和促进M2巨噬细胞极化在促进ccRCC进展中发挥关键作用，代表了ccRCC治疗的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circABCA1在ccRCC胆固醇代谢紊乱和M2巨噬细胞极化中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- circABCA1通过与IGF2BP3结合形成三元复合物稳定SCARB1 mRNA，增加SCARB1表达，促进胆固醇摄取，同时通过维持脂筏和激活IGF1R/PI3K/AKT/mTOR通路抑制脂自噬，减少胆固醇流出，进而促进M2巨噬细胞极化。
- 主要证据
- 在Caki-1和786-O细胞中，si-circABCA1降低SCARB1表达和胆固醇摄取并增加流出，SCARB1过表达则逆转；体内异种移植和肝转移模型证实circABCA1促进肿瘤生长和转移且依赖于SCARB1；RIP、RNA pull-down和双荧光素酶实验证实三元复合物形成机制。
- 研究意义
- 该研究揭示了circABCA1-IGF2BP3-SCARB1轴在ccRCC胆固醇代谢和肿瘤微环境重编程中的核心作用，为ccRCC治疗提供了潜在的新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估circABCA1对ccRCC细胞增殖迁移和胆固醇水平的影响
探讨circABCA1在ccRCC细胞中的功能作用及其对胆固醇代谢的调节。
通过siRNA敲低circABCA1，进行CCK-8、克隆形成、Transwell和RNA-seq实验。检测总胆固醇水平，并通过MβCD处理验证circABCA1对胆固醇的调节作用。
验证circABCA1-SCARB1轴对胆固醇摄取和流出的影响
确定SCARB1是否介导circABCA1对胆固醇代谢的调节。
通过RNA-seq和RT-qPCR检测SCARB1表达，使用DiI-HDL和BODIPY-胆固醇进行摄取实验，使用胆固醇流出试剂盒测量流出速率。通过过表达或敲低SCARB1进行功能回复实验。
阐明circABCA1-IGF2BP3-SCARB1 mRNA三元复合物形成机制
揭示circABCA1稳定SCARB1 mRNA的分子机制。
通过MS2 RNA pull-down和质谱鉴定IGF2BP3为结合蛋白，通过RIP、RNA pull-down、RNA-FISH、双荧光素酶报告基因和mRNA半衰期实验证明三元复合物的形成及对SCARB1 mRNA的稳定性增强。
研究circABCA1-SCARB1轴对脂自噬和胆固醇流出的调控
探讨si-circABCA1诱导的自噬是否通过脂自噬促进胆固醇流出。
通过western blot检测LC3B/LC3A比值和P62水平，使用氯喹抑制自噬，通过免疫荧光和透射电镜观察脂滴与自噬体的共定位。测量游离胆固醇、胆固醇酯和总胆固醇水平。
验证circABCA1-SCARB1轴通过脂筏和IGF1R/PI3K/AKT/mTOR通路调节自噬
阐明si-circABCA1促进自噬的信号机制。
使用MβCD破坏脂筏，通过CT-B染色评估脂筏含量和完整性，并通过western blot检测IGF1R、PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平。
评估circABCA1-SCARB1轴对M2巨噬细胞极化的影响
探究circABCA1-SCARB1轴是否通过影响胆固醇微环境促进M2巨噬细胞极化。
建立ccRCC细胞与M2巨噬细胞共培养体系，通过BODIPY染色检测巨噬细胞脂质含量，RT-qPCR检测M1/M2标志基因表达，ELISA检测TNF-α水平。
体内实验验证circABCA1-SCARB1轴对肿瘤生长和转移的促进作用
在体内验证circABCA1-SCARB1轴对ccRCC增殖和转移的促进作用。
建立皮下异种移植瘤模型和肝转移模型，通过瘤内注射siRNA或过表达载体处理，记录肿瘤体积和重量，通过IHC检测Ki67和SCARB1，通过H&E染色评估转移。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | Med Chem Express | HY-18739 | |
| 白细胞介素-4 | Med Chem Express | HY-P70445 | |
| 药物处理 | 甲基-β-环糊精 | Med Chem Express | HY-101461 |
| 氯喹 | Med Chem Express | HY-17589A | |
| 雷帕霉素 | TargetMol | T1537 | |
| 胆固醇 | Med Chem Express | HY-N0322 | |
| 替西罗莫司 | Med Chem Express | HY-50910 | |
| RNA提取和RT-qPCR | RNA保存液 | Thermo Fisher | -- |
| 质粒构建和细胞转染 | pLC5-ciR载体 | RRID: Addgene_169139 | -- |
| pCDH-SCARB1质粒 | Tsingke | -- | |
| RNA pull-down | 生物素标记RNA探针 | GENESEED | -- |
| 链霉亲和素偶联磁珠 | Invitrogen | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| SDS上样缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Cholesterol quantification | 总胆固醇检测试剂盒 | Applygen | -- |
| 胆固醇检测 | 胆固醇/胆固醇酯定量检测试剂盒 | Abcam | -- |
| 胆固醇流出实验 | 胆固醇流出检测试剂盒 | Abcam | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂 | TargetMol | -- |
| Click-iT EdU检测试剂盒 | Bioscience | -- | |
| RNA免疫沉淀 | Magna RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | -- |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | -- | -- |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件：Caki-1、786-O、HK-2和THP-1细胞系，培养基于DMEM或RPMI-1640，PMA处理THP-1为M0巨噬细胞 阅读提示：Materials and methods: Cell lines and cell culture |
| siRNA转染 | siRNA序列和转染条件，敲低效率验证 阅读提示：Materials and methods: Plasmids, siRNAs and cell transfection; Supplementary Table S5 |
| 胆固醇摄取和流出检测 | DiI-HDL浓度 (25 μg/mL)、BODIPY-胆固醇浓度 (1 μM)、孵育时间、胆固醇流出检测步骤 阅读提示：Materials and methods: Cholesterol uptake assay for imaging or flow cytometry; Cholesterol efflux assay |
| RNA稳定性分析 | Actinomycin D浓度 (10 μg/mL) 和处理时间 阅读提示：Materials and methods: Actinomycin D (ActD) assay |
| 体内实验 | 小鼠品系和品系（NSG，4周龄）、肿瘤细胞数量和植入方式、siRNA给药剂量（10 nmol）和频率（每两天），肿瘤体积测量时间（每5天） 阅读提示：Materials and methods: In vivo tumorigenesis and metastasis assays |