Sorafenib inhibits ovarian inflammation and fibrosis in polycystic ovary syndrome by targeting the PDGFA/PDGFRα/NF-κB pathway in granulosa cells†
包含体内动物模型（letrozole诱导PCOS小鼠）、体外细胞实验（KGN、THP-1）、转录组分析（RNA-seq、GEO数据）等多层级验证，并有功能验证（代谢指标、排卵、纤维化指标）和机制验证（NF-κB通路）。
letrozole诱导的PCOS小鼠模型 KGN人卵巢颗粒细胞系 PMA处理的THP-1巨噬细胞 GSE34526数据集（人颗粒细胞样本）
PCOS模型建立：4周龄C57BL/6雌性小鼠，letrozole（50 μg/kg/天）灌胃，高脂饮食，持续21天。 索拉非尼处理：10 mg/kg/天腹腔注射，持续21天。 体外实验：KGN细胞用PDGF-AA处理，索拉非尼预处理，检测NF-κB通路。 巨噬细胞共培养：THP-1细胞PMA处理48小时，与KGN非接触共培养24小时。 RNA-seq分析：每组4个生物学重复，差异基因筛选阈值adj.P<0.05且|Log2FC|>1。
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立PCOS小鼠模型，验证索拉非尼对代谢紊乱的影响。
4周龄C57BL/6雌性小鼠随机分为对照组和PCOS组，PCOS组每日灌胃letrozole（50 μg/kg）并喂食高脂饮食，持续21天；对照组灌胃溶媒并喂食普通饮食。此后，各组再分为索拉非尼处理组和未处理组，索拉非尼组每日腹腔注射10 mg/kg索拉非尼，持续21天。期间监测体重、卵巢重量，并进行GTT、ITT、血清睾酮检测、阴道涂片、卵巢组织学检查（H&E）和脂肪组织分析。
评估PCOS小鼠的排卵和生育力缺陷及索拉非尼的改善作用。
索拉非尼处理21天后，小鼠接受超促排卵（PMSG 10 IU，48小时后hCG 10 IU）。15小时后收集卵丘-卵母细胞复合体，计数排卵数；进行体外受精，评估胚胎发育至2细胞、4细胞和桑葚胚阶段；另将小鼠与雄鼠交配，统计着床数和第一胎产仔数。
评估PCOS小鼠卵巢炎症水平及索拉非尼的抑制作用。
通过免疫组化染色检测F4/80表达，免疫荧光检测IL-1β和iNOS表达，Western blot检测PDGFRα、p-IKKα/IKKβ、p-p65、p65、NLRP3等蛋白水平。
评估PCOS小鼠卵巢纤维化水平及索拉非尼的改善作用。
通过PSR染色和Masson染色评估胶原沉积，免疫荧光检测Col4a1，qPCR检测α-SMA、TGF-β1、Col4a1、fibronectin的mRNA，Western blot检测LOX、Col1a1、Col4a1、α-SMA、CTGF、TGF-β1蛋白水平，免疫组化检测α-SMA和CTGF。
探究索拉非尼处理对PCOS小鼠卵巢转录组的影响。
对对照组、PCOS组和PCOS+索拉非尼组（每组4个生物重复）的卵巢组织进行RNA-seq，鉴定差异表达基因，并进行GSEA和GO富集分析。此外，利用公共数据集GSE34526（人颗粒细胞样本）验证PDGF通路与纤维化通路的相关性。
验证索拉非尼在KGN细胞中对PDGF-AA诱导的NF-κB活化的抑制作用。
人卵巢颗粒细胞系KGN细胞，用索拉非尼预处理后加入PDGF-AA刺激，检测炎症因子表达（IL-18、TNF-α）、趋化因子水平（CCL23、CCL2、CCL8）、NF-κB通路蛋白磷酸化及p65核转位。
验证索拉非尼通过影响颗粒细胞分泌因子来抑制巨噬细胞迁移和M1极化。
通过transwell迁移实验评估KGN细胞条件培养基对THP-1巨噬细胞迁移的影响（8μm孔径），通过非接触共培养系统（0.4μm孔径）评估KGN细胞对THP-1细胞极化的影响，检测iNOS表达（M1标志）。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 模型建立 | 来曲唑 | Selleck | CGS 20267 |
| 药物处理 | 索拉非尼 | Selleck | BAY 43-9006 |
| 流式分析 | FSHR抗体 | Bioss | bs-20658R-PE |
| 血清激素测量 | ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 组织学染色 | Masson三色染色试剂盒 | -- | -- |
| 抗体孵育 | NCM通用抗体稀释液 | New Cell & Molecular Biotech | -- |
| 免疫组化 | 通用两步检测试剂盒 | ZSGB-BIO | PV-9000 |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488 AffiniPure 驴抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 |
| Cy3 AffiniPure 驴抗山羊IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-165-147 | |
| RNA提取 | EZB试剂盒 | -- | -- |
| 逆转录 | HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | -- |
| qPCR | SYBR Green PCR试剂盒 | Vazyme | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制 | cOmplete蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| 磷酸酶抑制 | PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8检测 | New Cell & Molecular Biotech | -- |
| 细胞迁移 | Transwell 24孔板 | Costar | -- |
| 共培养 | Transwell细胞培养插入件 | Costar | -- |
| 超促排卵 | 孕马血清促性腺激素 | -- | -- |
| 人绒毛膜促性腺激素 | Nanjing Aibei Biotechnology | -- | |
| 胚胎培养 | M2培养基 | -- | -- |
| HTF培养基 | Nanjing Aibei Biotechnology | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系（C57BL/6）、年龄（4周）、letrozole剂量（50 μg/kg/天）、给药方式（口服灌胃）、高脂饮食成分（见补充表S1）、处理持续时间（21天） 阅读提示：Materials and methods: Animal experimental design |
| 索拉非尼处理 | 索拉非尼剂量（10 mg/kg/天）、给药方式（腹腔注射）、持续时间（21天）、对照组溶剂（DMSO） 阅读提示：Materials and methods: Animal experimental design |
| 体外细胞实验 | KGN细胞培养条件（DMEM+10%FBS+1%青霉素-链霉素）、PDGF-AA处理浓度、索拉非尼预处理浓度和时间 阅读提示：Materials and methods: Cells culture and treatment |
| 巨噬细胞共培养实验 | THP-1细胞PMA处理浓度和时间（48小时）、共培养时间（24小时）、孔径（0.4 μm） 阅读提示：Materials and methods: Transwell assay and co-culture |
| RNA-seq分析 | 每组生物学重复数（4）、测序平台（Illumina NovaSeq 6000）、比对参考基因组（GRCm39）、DEG筛选阈值（调整后P<0.05且|Log2FC|>1）、GSEA软件版本（4.0.0） 阅读提示：Materials and methods: RNA sequencing and analysis |
