分离、鉴定和分组ADSC-EVs
获得并验证具有典型特征的ADSC-EVs，用于后续实验。
培养ADSCs至第3代，通过超速离心法分离ADSC-EVs。使用透射电镜观察形态，NTA分析粒径，Western blot检测表面标志物（CD9、CD81、TSG101、Calnexin）。ADSC-EVs分为GW组（EV抑制剂GW4869处理）和EVs组。
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脂肪间充质干细胞来源的细胞外囊泡通过介导ADAM17/MerTK影响脓毒症相关急性肾损伤后肾小管上皮细胞凋亡中巨噬细胞胞葬作用的机制
Mechanism of adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles affecting macrophage efferocytosis by mediating ADAM17/MerTK in the apoptosis of tubular epithelial cells after sepsis-associated acute kidney injury
实验完整度
高研究包含细胞实验（巨噬细胞、Jurkat细胞）和动物模型（CLP诱导的S-AKI小鼠），并进行了功能获得和丧失实验（oe-ADAM17、si-MerTK）及体内验证，证据层级完整。
主要模型
CLP诱导的S-AKI小鼠模型 小鼠肾巨噬细胞（CP-M187） 凋亡Jurkat细胞共培养体系
重点核对
小鼠模型：C57BL6/J雄性小鼠，10周龄，22±2g 分组：Sham、S-AKI、S-AKI+EVs、S-AKI+GW、S-AKI+EVs+Adoe-ADAM17、S-AKI+EVs+Adoe-NC，每组12只 ADSC-EVs处理：200μg EVs静脉注射，CLP后立即进行 细胞实验：LPS浓度10μg/mL，EVs浓度20μg/mL，处理时间24小时 si-MerTK和oe-ADAM17转染浓度100nM 凋亡Jurkat细胞制备：254nm紫外照射15分钟 胞葬作用检测：pHrodo-red标记凋亡细胞，共培养45分钟
摘要
目的：本研究探讨脂肪间充质干细胞来源的细胞外囊泡（ADSC-EVs）通过调节ADAM17/MerTK介导的巨噬细胞胞葬作用改善脓毒症相关急性肾损伤（S-AKI）后肾小管上皮细胞（TEC）凋亡的分子机制。方法：通过盲肠结扎穿刺建立S-AKI小鼠模型，并静脉注射ADSC-EVs。用LPS培养小鼠肾脏巨噬细胞，转染oe-ADAM17或si-MerTK的同时与EVs共培养，然后与Jurkat细胞共孵育。使用比色法、免疫组织化学、Western blot和ELISA测定小鼠血清尿素和肌酐、KIM-1、胞葬作用和凋亡相关蛋白、炎症因子、细胞因子和可溶性MerTK（sMerTK）水平。分别通过HE染色、TUNEL染色、免疫荧光和流式细胞术评估肾小管损伤、TEC凋亡、巨噬细胞胞葬作用和M1/M2极化水平。进行了体内验证实验。结果：S-AKI小鼠表现出血清尿素、肌酐、KIM-1、促炎因子、促凋亡蛋白和ADAM17蛋白水平升高，抗凋亡蛋白和MerTK蛋白水平降低，M2极化减弱。ADSC-EVs下调ADAM17和sMerTK，增加S-AKI小鼠肾组织和LPS诱导的小鼠肾巨噬细胞中细胞膜MerTK、巨噬细胞对凋亡细胞的识别和胞葬作用以及M2极化，表明ADSC-EVs调节ADAM17/MerTK介导的巨噬细胞胞葬作用并促进M2极化。MerTK沉默部分逆转了ADSC-EVs调节的LPS诱导的小鼠肾巨噬细胞胞葬作用和M2极化。在体内，ADAM17上调部分逆转了ADSC-EVs调节的小鼠肾组织S-AKI后TEC凋亡。结论：ADSC-EVs通过调节ADAM17下调sMerTK水平并上调巨噬细胞膜MerTK蛋白水平，促进巨噬细胞胞葬作用，改善S-AKI后TEC凋亡和炎症。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ADSC-EVs是否通过调节ADAM17/MerTK介导的巨噬细胞胞葬作用来改善脓毒症相关急性肾损伤（S-AKI）后肾小管上皮细胞（TEC）的凋亡和炎症？
- 核心机制
- ADSC-EVs抑制ADAM17表达，从而减少MerTK的裂解，上调巨噬细胞膜MerTK蛋白水平，促进巨噬细胞对凋亡细胞的胞葬作用，并诱导M2极化，最终减轻TEC凋亡和炎症。
- 主要证据
- 在CLP诱导的S-AKI小鼠模型和LPS刺激的小鼠肾巨噬细胞中，ADSC-EVs下调ADAM17和sMerTK，上调膜MerTK，增强胞葬作用和M2极化；si-MerTK部分逆转这些效应；体内ADAM17过表达部分逆转ADSC-EVs的改善作用。
- 研究意义
- 本研究阐明了ADSC-EVs调节S-AKI进程的作用和分子机制，为治疗S-AKI提供了潜在靶点，并为探索新的治疗方式提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立S-AKI小鼠模型并分组处理
建立S-AKI模型，并评估ADSC-EVs对S-AKI小鼠肾损伤的影响。
通过CLP建立S-AKI小鼠模型，小鼠分为Sham、S-AKI、S-AKI+EVs、S-AKI+GW、S-AKI+EVs+Adoe-ADAM17、S-AKI+EVs+Adoe-NC组。EVs组、GW组、Adoe-ADAM17组和Adoe-NC组在CLP后立即静脉注射相应物质。术后24h收集血液和肾组织。
评估ADSC-EVs对体外巨噬细胞的影响
验证ADSC-EVs对LPS诱导的巨噬细胞ADAM17表达、胞葬作用和M2极化的影响。
小鼠肾巨噬细胞用LPS诱导，并同时用ADSC-EVs或GW处理。通过EV摄取实验验证内化。RT-qPCR和Western blot检测ADAM17表达。共培养凋亡Jurkat细胞后，免疫荧光检测胞葬作用，流式细胞术检测M1/M2极化，ELISA检测炎症因子水平。
验证ADAM17/MerTK在ADSC-EVs调控巨噬细胞功能中的作用
探究ADSC-EVs是否通过抑制ADAM17减少MerTK裂解来促进胞葬作用和M2极化。
在LPS+EVs组巨噬细胞中转染oe-ADAM17或si-MerTK，检测ADAM17、MerTK和sMerTK表达，以及胞葬作用、M1/M2极化和炎症因子水平。
体内验证ADAM17/MerTK通路
在体内验证ADAM17上调是否逆转ADSC-EVs对S-AKI小鼠的保护作用。
在S-AKI小鼠中，通过Adoe-ADAM17过表达ADAM17，检测肾组织ADAM17和MerTK表达、肾功能（Scr、BUN）、肾小管损伤、TEC凋亡和炎症因子水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良 Eagle 培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 脂肪间充质干细胞 | Otwo Biotech | HTX2309 | |
| EV分离与鉴定 | PKH67荧光染料 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞培养 | GW4869 | Sigma-Aldrich | D1692 |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| 罗哌卡因 | -- | -- | |
| EV分离 | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| EV鉴定 | 磷钨酸 | -- | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | -- | -- | |
| 抗Bcl-2抗体 | Abcam | ab182858 | |
| 抗Bax抗体 | Abcam | ab32503 | |
| 抗Cleaved Caspase-3抗体 | Abcam | ab32042 | |
| 抗ADAM17抗体 | Abcam | ab39162 | |
| 抗MerTK抗体 | Abcam | ab300136 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | |
| 辣根过氧化物酶偶联二抗 | Abcam | ab6721 | |
| 辣根过氧化物酶偶联二抗 | Abcam | ab205719 | |
| RT-qPCR | 总RNA提取试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| SYBR Green实时PCR预混液 | Toyobo | -- | |
| ELISA | IL-6 ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKM-0007 |
| MCP-1 ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKM-0108 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKM-0034 | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKM-0002 | |
| IL-13 ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKM-0014 | |
| iNOS ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKM-0270 | |
| IL-10 ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKM-0010 | |
| IL-4 ELISA试剂盒 | Solarbio | SEKM-0005 | |
| MerTK ELISA试剂盒 | Abcam | ab210572 | |
| 细胞功能实验 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| pHrodo-red荧光染料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 动物模型 | ADAM17过表达腺病毒 | VectorBuilder | -- |
| 阴性对照腺病毒 | VectorBuilder | -- | |
| 组织病理学 | HE染色试剂盒 | Solarbio | G1120-100 |
| TUNEL检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 柠檬酸盐缓冲液 | Solarbio | -- | |
| 蛋白酶K | -- | -- | |
| 过氧化氢 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 抗CD68抗体 | Abcam | ab213363 |
| 抗ADAM17抗体 | Abcam | ab39162 | |
| 抗MerTK抗体 | Abcam | ab300136 | |
| 抗CD206抗体 | Abcam | ab64693 | |
| 抗CD86抗体 | Abcam | ab213045 | |
| 山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor 594)二抗 | Abcam | ab150080 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor 488)二抗 | Abcam | ab150113 | |
| 山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor 488)二抗 | Abcam | ab150077 | |
| DAPI染色液 | Solarbio | C0065 | |
| 流式细胞术 | 抗CD68抗体 | Abcam | ab283654 |
| 抗CD86抗体 | Abcam | ab242142 | |
| 抗CD206抗体 | Bioss | bs-4727R | |
| 山羊抗兔IgG (Alexa Fluor 488)二抗 | Abcam | ab150081 | |
| 肾功能检测 | 肌酐检测试剂盒 | JianCheng Bioengineering Institute | C011-2-1 |
| 尿素氮检测试剂盒 | JianCheng Bioengineering Institute | C013-1-1 | |
| 细胞处理 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞培养 | 小鼠肾巨噬细胞完全培养基 | Punosai Life Technology | CM-M187 |
| 小鼠肾巨噬细胞 | Punosai Life Technology | CP-M187 | |
| Jurkat细胞 | -- | -- | |
| EV分离 | 0.22 μm细胞过滤器 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ADSC-EVs分离与鉴定 | ADSCs培养条件、EV分离参数（转速、时间）、GW4869处理浓度和时长，以及表面标志物抗体用量。 阅读提示：Materials and methods 中的“Separation, identification and grouping of ADSC-EVs”部分。 |
| S-AKI小鼠模型建立 | 小鼠品系、性别、周龄、体重、CLP手术细节（结扎位置、针头规格、穿刺次数）、术后镇痛和补液、分组数及每组动物数。 阅读提示：Materials and methods 中的“Establishment and grouping of the S-AKI mouse model”部分。 |
| 细胞处理与转染 | LPS和EVs的浓度、处理时间，oe-ADAM17和si-MerTK的转染浓度、转染试剂及时间。 阅读提示：Materials and methods 中的“Cell grouping and treatment”部分。 |
| 胞葬作用检测 | 凋亡Jurkat细胞的制备（紫外照射时间和剂量）、pHrodo-red标记浓度、共培养比例和时间。 阅读提示：Materials and methods 中的“Cell grouping and treatment”和“Immunofluorescence”部分。 |
| 肾功能检测 | 血清收集方法、离心参数、检测试剂盒的型号和使用步骤。 阅读提示：Materials and methods 中的“Kidney function tests”部分。 |
| 组织病理学检测 | 固定剂和固定时间、切片厚度、染色试剂盒和染色步骤、评分标准。 阅读提示：Materials and methods 中的“HE staining”和“TUNEL staining”部分。 |
| 免疫荧光 | 一抗和荧光二抗的浓度、孵育时间和温度、封片剂和图像分析软件。 阅读提示：Materials and methods 中的“Immunofluorescence”部分。 |
| Western blot | 蛋白提取方式、抗体种类、稀释比例、孵育条件和内参蛋白。 阅读提示：Materials and methods 中的“Western blot”部分。 |