建立慢性移植物抗宿主病小鼠模型
模拟人类慢性移植物抗宿主病，观察眼部表型并评估治疗干预效果。
通过异基因骨髓移植（B10.D2/nSnSlc→BALB/cCrSlc）建立慢性移植物抗宿主病小鼠模型，同基因骨髓移植（BALB/cCrSlc→BALB/cCrSlc）作为非移植物抗宿主病对照。受体小鼠接受7-Gy照射，尾静脉注射供体骨髓细胞（1×10^6细胞/只）和脾细胞（2×10^6细胞/只）。移植后第28天和第42天进行实验。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
内质网应激促进眼睑及眼表移植物抗宿主病的发展
Endoplasmic reticulum stress contributes to the development of ocular graft-vs-host disease in the eyelids and the ocular surface
实验完整度
高包含异基因和同基因骨髓移植小鼠模型、体外成纤维细胞培养、免疫印迹、免疫组化、电镜、角膜荧光素染色等多个独立证据层级，并有功能验证和机制验证。
主要模型
慢性移植物抗宿主病小鼠模型（B10.D2/nSnSlc供体→BALB/cCrSlc受体） 同基因骨髓移植对照小鼠模型（BALB/cCrSlc供体→BALB/cCrSlc受体） 慢性移植物抗宿主病小鼠眼睑来源的原代成纤维细胞
重点核对
BMT后第28天和第42天的时间点 PBA腹腔注射剂量为10 mg/kg，每日一次 PBA滴眼液浓度为2%，每日两次 角膜荧光素染色评分（0-16分） PBA补充浓度10^-6 M处理原代成纤维细胞24小时
摘要
背景：虽然内质网应激已被认为与移植物抗宿主病的多个方面有关，但其对慢性移植物抗宿主病患者眼睑和眼表的影响仍知之甚少。我们旨在使用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸探讨内质网应激与眼部移植物抗宿主病之间的关系。方法：本研究使用异基因骨髓移植和同基因骨髓移植建立慢性移植物抗宿主病小鼠模型。在骨髓移植后，对慢性移植物抗宿主病小鼠给予腹腔注射PBA或2%PBA滴眼液治疗。结果：与溶剂处理的慢性移植物抗宿主病小鼠相比，腹腔注射PBA组保留了较大的睑板腺面积，并且眼表的角膜上皮损伤以及炎症和纤维化细胞浸润得到减轻。与同基因对照和PBA腹腔注射组相比，溶剂组中未折叠蛋白反应标志物的表达显著升高。电子显微镜和免疫组织化学显示，成纤维细胞和巨噬细胞在内质网应激下浸润了慢性移植物抗宿主病小鼠的眼睑和眼表。PBA滴眼液组的角膜荧光素染色评分显著低于溶剂处理组。与溶剂组相比，PBA滴眼液组中白细胞标志物CD45、T细胞标志物CD4和巨噬细胞标志物F4/80阳性细胞的数量显著减少。结论：该研究表明，由慢性移植物抗宿主病在眼表组织中触发的内质网应激反应可被内质网应激抑制剂PBA抑制，这可能为眼部移植物抗宿主病提供治疗益处。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 内质网应激是否参与眼部移植物抗宿主病的发病机制，以及通过内质网应激抑制剂PBA进行全身或局部给药是否能减轻眼部移植物抗宿主病的严重程度。
- 核心机制
- 慢性移植物抗宿主病诱发眼睑和眼表组织中的内质网应激反应，通过ATF6α/TXNCD5/TGF-βR1/SMAD3信号轴促进巨噬细胞向肌成纤维细胞转化，从而加剧眼睑和眼表的炎症与纤维化。
- 主要证据
- 在慢性移植物抗宿主病小鼠模型中，腹腔注射PBA减少了睑板腺萎缩、角膜上皮损伤、炎症细胞浸润和纤维化，并降低了未折叠蛋白反应标志物表达；PBA滴眼液减少了角膜炎症细胞浸润和角膜上皮损伤。
- 研究意义
- 内质网应激部分影响眼部移植物抗宿主病的表现，PBA可能成为眼部移植物抗宿主病的可行治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全身和局部给药PBA
评估内质网应激抑制剂PBA通过全身和局部途径给药对慢性移植物抗宿主病眼部表型的影响。
在移植后第10天至27天或第10天至41天，每日一次腹腔注射PBA（10 mg/kg）或PBS载体。另一组在移植后第7天至27天，每日两次给予2% PBA滴眼液或PBS滴眼液。
评估眼部临床表型
评估PBA对睑板腺形态、角膜上皮损伤和临床移植物抗宿主病评分的影响。
收集眼睑并进行睑板腺成像，计算睑板腺面积百分比。使用角膜荧光素染色评分评估角膜上皮损伤。记录临床移植物抗宿主病评分（0-14分）。
分析眼睑组织病理学
评估PBA对眼睑炎症细胞浸润和纤维化的影响。
对眼睑组织进行H&E染色和Mallory染色，观察炎症浸润和纤维化。通过免疫组化检测CD45（白细胞标志物）和α-SMA（肌成纤维细胞标志物）阳性区域的面积。
检测内质网应激标志物表达
评估慢性移植物抗宿主病小鼠眼睑组织中内质网应激相关蛋白的表达水平，以及PBA的影响。
通过蛋白质印迹分析眼睑组织中GRP78、p-IRE1α、p-PERK和ATF6α的表达。使用电子显微镜观察眼睑中成纤维细胞和巨噬细胞的内质网形态。通过免疫组化检测HSP47+GRP78+、HSP47+p-PERK+、HSP47+p-IRE1α+、HSP47+ATF6α+细胞的数量。
分析巨噬细胞和成纤维细胞中内质网应激及信号通路
探讨PBA对巨噬细胞和成纤维细胞中内质网应激相关通路及巨噬细胞-肌成纤维细胞转化（MMT）的影响。
通过免疫组化检测CD68（巨噬细胞标志物）与p-PERK、p-IRE1α的共表达，以及CD68、ATF6α、α-SMA三染以识别MMT细胞。检测TGF-β通路相关蛋白（TGF-β、p-SMAD3、TGF-β R1、TXNDC5）的表达。通过qPCR检测眼睑组织中Tgfb1 mRNA表达。
体外成纤维细胞培养和IL-6检测
验证PBA对慢性移植物抗宿主病小鼠眼睑来源成纤维细胞中IL-6分泌的影响。
分离培养眼睑来源的成纤维细胞，用10^-6 M PBA处理24小时，收集培养上清，通过ELISA检测IL-6浓度。
评估角膜炎症细胞浸润
评估PBA滴眼液对慢性移植物抗宿主病小鼠角膜中炎症细胞浸润的影响。
使用角膜全组织免疫染色，检测角膜中CD45+、F4/80+和CD4+细胞的浸润情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 4-苯基丁酸 | Sigma-Aldrich | SML0309 |
| 骨髓移植 | 伽马射线源 | Hitachi Medico, Ltd. | -- |
| 眼睑成像 | SZ61显微镜 | Olympus | -- |
| 免疫组织化学 | CD68抗体 | Biolegend | 137008 |
| APC标记CD45抗体 | BioLegend | 103112 | |
| HSP47抗体 | Enzo Life Science | ADI-SPA-470-F | |
| ATF6α抗体 | Novus Biologicals | NBP1-75478 | |
| p-IRE1α抗体 | Novus Biologicals | NB100-2323 | |
| p-PERK抗体 | Bioss Antibodies | bs-3330R | |
| GRP78抗体 | Abcam | ab21685 | |
| α-SMA抗体 | Abcam | ab7817 | |
| TGF-β抗体 | Proteintech | 21898-1-AP | |
| p-SMAD3抗体 | GeneTex | GT1207 | |
| TGF-β R1抗体 | LSBio | LS-B9436-50 | |
| TXNDC5抗体 | GeneTex | GTX65848 | |
| 抗原修复液 | Agilent Technologies | S169984 | |
| 正常山羊血清 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 012-000-120 | |
| DAPI | -- | -- | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗大鼠IgG二抗 | Thermo Fisher Scientific | A11006 | |
| Alexa Fluor 568标记山羊抗兔IgG二抗 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 568标记山羊抗大鼠IgG二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-11077 | |
| Alexa Fluor 647标记山羊抗小鼠IgG二抗 | Thermo Fisher Scientific | A150115 | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG二抗 | Thermo Fisher Scientific | A11029 | |
| Alexa Fluor 488标记兔抗山羊IgG二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-11078 | |
| THUNDER Imager 3D细胞培养成像系统 | Leica | -- | |
| 角膜全组织染色 | 甲醛 | Fuji Film | 133-10311 |
| 氯化镁 | Nakarai | 95812-85 | |
| EGTA | Nakarai | 37346-05 | |
| NP-40 | Nakarai | 25223-04 | |
| 二甲基亚砜 | Nakarai | 13407-45 | |
| Triton X-100 | Nakarai | 35501-02 | |
| 正常山羊血清 | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | |
| FITC标记CD4抗体 | Biolegend | 100510 | |
| 别藻蓝蛋白标记CD45抗体 | BioLegend | 103112 | |
| 藻红蛋白标记F4/80抗体 | BioLegend | 157303 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| 荧光封片剂 | Agilent Technologies | S302380-2 | |
| 载玻片 | Matsunami | MAS-01 | |
| 透射电子显微镜 | 透射电子显微镜（1230 EXII） | JOEL | -- |
| RNA提取和qPCR | miRNeasy小型试剂盒 | Qiagen | 217004 |
| ReverTra Ace qPCR逆转录试剂盒 | Toyobo | FSQ-101 | |
| StepOnePlus系统 | Thermo Fisher Scientific | 4379216 | |
| Tgfb1引物（Mm01178820_m1） | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 角膜荧光素染色 | 荧光素钠溶液 | Novartis Pharma | Fluorescite 877290 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 荧光母液 | ProteinSimple | PS-FL01-8 | |
| Wes分离模块 | ProteinSimple | SM-W004 | |
| 抗兔检测模块 | ProteinSimple | DM-001 | |
| 抗GRP78抗体 | Abcam | ab21685 | |
| ATF6α抗体 | Novus Biologicals | NBP1-75478 | |
| p-IRE1α抗体 | Novus Biologicals | NB100-2323 | |
| p-PERK抗体 | Bioss Antibodies | bs-3330R | |
| 磷酸化eIF2α抗体 | Cell Signaling | 3597 | |
| ELISA | IL-6 ELISA试剂盒 | R&D Systems | M6000B |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 骨髓移植 | 小鼠品系、年龄、性别、照射剂量、细胞数量 阅读提示：Materials and methods: Mice, Whole bone marrow transplantation |
| PBA给药 | 给药途径、剂量、频率、时间、溶剂 阅读提示：Materials and methods: Treatment of allogeneic BMT recipient mice with 4-PBA |
| 睑板腺成像 | 取材时间、图像采集方法、面积计算 阅读提示：Materials and methods: Eyelid imaging |
| 组织病理学 | 固定、包埋、染色方法 阅读提示：Materials and methods: Histological analysis |
| 免疫组织化学 | 抗体、稀释比例、抗原修复、染色步骤 阅读提示：Materials and methods: Immunohistochemistry |
| 角膜全组织染色 | 固定、透化、抗体浓度、孵育时间 阅读提示：Materials and methods: Corneal whole mount staining |
| 透射电子显微镜 | 固定、脱水、包埋、切片、染色 阅读提示：Materials and methods: Electron microscopy |
| RNA提取和qPCR | 引物、内参基因、分析方法 阅读提示：Materials and methods: RNA isolation and real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) |
| 角膜荧光素染色 | 荧光素浓度、评分系统 阅读提示：Materials and methods: Corneal fluorescein staining |
| 原代成纤维细胞培养 | 取材、培养条件、PBA处理浓度和时间 阅读提示：Materials and methods: Primary culture of fibroblasts derived from the eyelid of a cGVHD mouse |
| 蛋白质印迹 | 样品制备、抗体、标准化方法 阅读提示：Materials and methods: Semi-automated immunoblotting |
| ELISA | 试剂盒、样品处理、重复数 阅读提示：Materials and methods: ELISA |
| 统计分析 | 统计检验方法、显著性水平 阅读提示：Materials and methods: Statistical analyses |