构建单细胞动脉粥样硬化图谱
整合多个 scRNA-seq 数据集，以全面表征人类动脉粥样硬化斑块中的细胞类型和状态。
整合了来自4项研究的10个动脉粥样硬化供体和3个对照供体的 scRNA-seq 数据，经过严格质控（包括双细胞去除和批次效应校正）后获得132,319个高质量单细胞，并通过 Leiden 聚类和标记基因表达注释了16种主要细胞类型。
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空间和单细胞RNA测序的全景视图更新了微血管在人类动脉粥样硬化中的作用
Encompassing view of spatial and single-cell RNA sequencing renews the role of the microvasculature in human atherosclerosis
实验完整度
高整合多项scRNA-seq和空间转录组学数据，并进行差异表达、通路、细胞通讯、轨迹分析；通过IHC/IF和体外流动实验进行功能验证。
主要模型
人类冠状动脉粥样硬化斑块（空间转录组学） 人类颈动脉和冠状动脉粥样硬化斑块（scRNA-seq） 人脐静脉内皮细胞（HUVEC） CD4+ T细胞
重点核对
ACKR1在血管滋养管内皮细胞中的表达及与CD4+ T细胞的邻近性（IF共定位） ACKR1敲低对CD4+ T细胞粘附和跨内皮迁移的影响（体外流动实验） VSMC向纤维肌细胞转分化的空间轨迹（Slingshot拟时间分析） 斑块和 adventitia 中细胞类型丰度的空间分布（cell2location 反卷积）
摘要
动脉粥样硬化是缺血性心脏病和中风的普遍诱因。尽管降脂疗法和抗高血压药物取得了进展，但动脉粥样硬化事件的残留风险仍然很高，开发治疗策略已被证明具有挑战性。这是由于动脉粥样硬化的复杂性，血管壁内多种细胞类型存在空间相互作用。在本研究中，我们结合来自多项研究的单细胞RNA测序数据和来自12个人类标本的不同阶段动脉粥样硬化的空间转录组学数据，生成了人类动脉粥样硬化斑块的整合高分辨率图谱。我们展示了细胞类型特异性和动脉粥样硬化特异性的表达变化以及细胞间通讯的空间受限改变。我们强调了淋巴细胞可能通过血管滋养管的ACKR1内皮细胞被募集，血管平滑肌细胞通过转化为纤维肌细胞向管腔迁移，以及斑块区域的细胞间通讯，表明人类动脉粥样硬化中外膜和内膜下空间内存在复杂的细胞相互作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类动脉粥样硬化斑块中不同细胞类型在空间上的组织方式及其细胞间通讯如何影响疾病进展，特别是微血管在其中的作用。
- 核心机制
- ACKR1+ 内皮细胞（血管滋养管）可能通过配体-受体相互作用（如 CCL5-ACKR1）促进外周淋巴细胞的募集；血管平滑肌细胞通过拟时间轨迹从外膜向管腔迁移并转分化为纤维肌细胞，伴随着细胞外基质重塑。
- 主要证据
- 整合 scRNA-seq 和空间转录组学数据，通过细胞通讯分析、空间共定位分析和拟时间轨迹分析，结合免疫荧光和体外流动实验验证了 ACKR1 在淋巴细胞募集中的作用以及 VSMC 的转分化。
- 研究意义
- 该研究为理解动脉粥样硬化中微血管的作用提供了高分辨率资源，可能为针对特定空间位置和细胞群的精准治疗开辟新途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
空间转录组学分析
探究不同细胞类型在动脉壁中的空间分布及其与疾病阶段的关系。
对12个人类冠状动脉标本（涵盖不同动脉粥样硬化阶段）进行了 10x Visium 空间转录组学分析，通过 H&E 染色分类疾病阶段，并使用 cell2location 反卷积估计细胞类型丰度，同时计算 Lumina-to-Periphery 评分以评估细胞类型的空间位置。
细胞间通讯分析
识别动脉粥样硬化中不同细胞类型之间潜在的配体-受体相互作用。
使用 CellPhoneDB、CrossTalkeR 和 MultiNicheNet 分析 scRNA-seq 数据中的细胞间通讯，并使用 LIANA 数据库和 COMMOT 进行空间细胞间通讯分析，以评估配体-受体的空间共定位。
淋巴细胞募集的功能验证
验证 ACKR1+ 内皮细胞在介导 CD4+ T 细胞粘附和迁移中的作用。
通过免疫荧光证实 ACKR1+ 内皮细胞与 CD4+ T 细胞在 human arteries 的 adventitia 中共定位。在体外流动实验中，使用 ACKR1 敲低的 HUVECs，评估了 CD4+ T 细胞的粘附和跨内皮迁移能力。
VSMC 转分化轨迹分析
探究血管平滑肌细胞（VSMC）向纤维肌细胞的转分化及其空间迁移。
使用 Slingshot 对 VSMC 亚群进行拟时间分析，揭示 VSMC 通过肌成纤维细胞向纤维肌细胞转变的轨迹，并通过 IHC 验证了早期动脉粥样硬化中纤维肌细胞在新内膜中的存在。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | MYOCD | Sigma-Aldrich | SAB4200539 |
| TNFRSF11B | Abcam | ab124820 | |
| PDGFRB | Invitrogen | MA5-14851 | |
| SLC2A4 | Bioss Antibodies | bs-038R | |
| FAP | Cell Signaling Technology | 66562 | |
| CD20 | Abcam | ab64088 | |
| 免疫荧光（ACKR1-CD4） | ACKR1 | Sigma-Aldrich | HPA17672 |
| CD4 | Dako | IR649 | |
| 细胞培养 | 人脐静脉内皮细胞 | PromoCell | C-12203 |
| 内皮细胞生长培养基2 | PromoCell | C-22011 | |
| 药物处理 | 肿瘤坏死因子 | PeproTech | 300-01A |
| 慢病毒包装 | TransIT | Mirus Bio | -- |
| 药物处理 | 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr-1 |
| 慢病毒包装 | shCTRL 质粒 | Merck | SHC002 |
| 免疫细胞分离 | Ficoll | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 |
| CD4+ T 细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-533 | |
| 细胞培养 | RPMI 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 61870036 |
| 体外流动实验 | μ-Slides VI 0.4 | Ibidi | -- |
| Vybrant DiO 或 DiD 细胞标记溶液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫荧光（体外实验） | 小鼠抗ACKR1 | Absolute Antibody | Ab00893-1.1 |
| 小鼠抗VE-钙粘蛋白 Alexa Fluor 488 | Abcam | ab272345 | |
| 鸡抗小鼠AF594 | Invitrogen | A21201 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1206 | |
| 空间转录组学 | VS200 玻片扫描仪 | Olympus Life Science | -- |
| NovaSeq 6000 测序平台 | Illumina | -- | |
| NovaSeq 6000 S2 试剂盒 1.5 版 | Illumina | -- | |
| 10x Visium 人类探针组版本1 | 10x Genomics | -- | |
| 免疫组化（Roche Ventana） | DAB | Roche | -- |
| 免疫荧光（ACKR1-CD4） | EnVision Dako 靶标修复液 | Dako | S2031 |
| Vectastain-ABC | Vector Laboratories | AK-5000 | |
| Vector Red | Vector Laboratories | SK5100 | |
| DAB | Agilent Technologies | K346811-2 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA测序数据整合 | 数据来源（4项研究）、供体数量和疾病状态、质控参数（最小200基因、最大20%线粒体reads、双细胞率<3%） 阅读提示：Methods: Data collection and pre-processing; Single-cell data integration and cell type annotations |
| 空间转录组学 | 样本数量（12）、疾病阶段分类、Visium 方案（FFPE）、切片厚度（5 µm）、测序平台（NovaSeq 6000） 阅读提示：Methods: Visium spatial transcriptomics; Figure 3a,b |
| 细胞间通讯分析 | 所用数据库和工具（CellPhoneDB、CrossTalkeR、MultiNicheNet、LIANA）、参数（如阈值、空间距离400 µm） 阅读提示：Methods: scRNA-seq cell-cell communication; Spatial differential expression and cell-cell communication |
| ACKR1功能验证 | 细胞系（HUVEC）、TNF处理浓度（10 ng/ml）和时间（4h）、ACKR1敲低方法（shRNA）、T细胞来源（健康供体）、流动剪切力（0.5 ml/min） 阅读提示：Methods: Cell lines, primary cells and shRNA treatment; Leukocyte isolation and transmigration under flow assay |
| VSMC转分化轨迹分析 | 拟时间分析工具（Slingshot）、聚类数（5）、IHC验证的标记物（MYOCD, PDGFRB, FAP/TNFRSF11B） 阅读提示：Methods: Trajectory analyses; Figure 8b |