患者样本收集与分组
获取IgG4 HT、非IgG4 HT和对照组的血清及甲状腺组织，用于后续检测。
收集2011-2013年间接受甲状腺切除术的HT患者血清和甲状腺组织，根据免疫组化染色分为IgG4 HT（n=18）和非IgG4 HT（n=17），并以单纯甲状腺乳头状微小癌患者的正常甲状腺组织作为对照（n=18）。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
IgG4糖基化通过补体途径参与IgG4型桥本甲状腺炎的发病机制
IgG4 glycosylation contributes to the pathogenesis of IgG4 Hashimoto's thyroiditis via the complement pathway
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内小鼠模型、患者组织样本及质谱分析等多个独立证据层级，并进行功能与机制验证。
主要模型
IgG4 HT患者血清及甲状腺组织 非IgG4 HT患者血清及甲状腺组织 新生C57/6J小鼠 Nthy-ori 3-1人甲状腺细胞系
重点核对
IgG4 HT与非IgG4 HT分组及血清TgAb IgG4、TPOAb IgG4水平 甲状腺组织中补体成分C1q、MBL、Bb、C3d、C4d、MAC的免疫组化评分 纯化IgG4注射新生小鼠的剂量（10 mg/g体重）和注射后24小时观察 TgAb IgG4糖基化模式分析（MALDI-TOF-MS）及G1F、G0F、M5峰对应质荷比 IgG4去糖基化处理条件（PNGase F，37°C，2h，体积比20:1）及MBL结合ELISA
摘要
背景：探讨IgG4是否参与IgG4型桥本甲状腺炎（IgG4 HT）的发病机制。方法：检测IgG4 HT和非IgG4 HT患者血清中的TgAb IgG4和TPOAb IgG4。通过免疫组化检测IgG4 HT、非IgG4 HT和对照组甲状腺组织中的C1q、甘露糖结合凝集素（MBL）、Bb、C3d、C4d和膜攻击复合物（MAC）。小鼠注射纯化IgG4后，通过免疫组化评估小鼠甲状腺中的IgG4和MAC沉积。通过MALDI-TOF-MS鉴定IgG4 HT患者TgAb IgG4的糖基化模式。通过ELISA评估去糖基化前后IgG4与MBL的结合能力。在加入IgG4或去糖基化IgG4后，检测甲状腺细胞中MBL和MAC的荧光。结果：IgG4 HT组血清TgAb IgG4和TPOAb IgG4水平显著升高。IgG4 HT甲状腺组织中MBL、Bb、C3d、C4d和MAC水平显著高于非IgG4 HT组（均P < 0.001）。免疫荧光显示IgG4与MBL共定位。小鼠注射来自IgG4 HT的IgG4后，观察到滤泡细胞结构破坏，以及IgG4与MAC的共定位。在IgG4 HT中检测到高水平的TgAb IgG4糖基化模式，包括单半乳糖聚糖（G1F）、半乳糖缺失聚糖（G0F）和高甘露糖聚糖（M5）。去糖基化后，IgG4与MBL结合能力降低，甲状腺细胞中MBL和MAC活化水平降低。结论：高水平的IgG4糖基化模式，包括G1F、G0F和M5，可能激活补体凝集素途径，从而参与IgG4 HT的发病机制。关键词：补体激活，糖基化，IgG4抗体，IgG4 HT，发病机制
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IgG4抗体是否通过其糖基化修饰激活补体系统，从而参与IgG4型桥本甲状腺炎的发病机制？
- 核心机制
- IgG4抗体上的N-聚糖（G1F、G0F、M5）与MBL结合，激活补体凝集素途径，进而形成MAC，导致甲状腺滤泡细胞损伤。
- 主要证据
- IgG4 HT患者甲状腺组织中MBL、Bb、C3d、C4d、MAC表达显著升高；IgG4与MBL共定位；小鼠注射IgG4后出现甲状腺损伤及IgG4与MAC共沉积；去糖基化后IgG4与MBL结合减弱，细胞上MBL和MAC沉积减少。
- 研究意义
- 首次揭示IgG4 HT患者IgG4糖基化在发病中的作用，为理解IgG4 HT发病机制提供新见解，并可能提供新的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
血清IgG4抗体水平检测
比较IgG4 HT与非IgG4 HT患者血清中TgAb IgG4和TPOAb IgG4水平。
采用ELISA法检测血清TgAb IgG4和TPOAb IgG4水平，抗原包被浓度分别为甲状腺球蛋白4 μg/mL、甲状腺过氧化物酶2 μg/mL，使用HRP标记的抗人IgG4抗体（1:5000或1:1000）检测。
甲状腺组织补体成分免疫组化检测
评估IgG4 HT、非IgG4 HT和对照组甲状腺组织中补体激活标志物的表达。
对甲状腺组织切片进行免疫组化染色，检测C1q、MBL、Bb、C3d、C4d和MAC，并根据染色强度和阳性细胞百分比评分。
IgG4与MBL共定位检测
验证IgG4 HT甲状腺组织中IgG4是否与MBL共定位。
采用免疫荧光双标染色，检测IgG4（绿色）和MBL（红色），并使用共聚焦显微镜观察。
小鼠体内验证IgG4致病性
验证来自IgG4 HT患者的IgG4是否能在体内诱导甲状腺损伤及补体激活。
将纯化的IgG4（来自IgG4 HT患者或健康供者）或PBS腹腔注射新生C57/6J小鼠，24小时后处死，取甲状腺组织进行HE染色和免疫组化检测IgG4、MAC和CD45。
IgG4糖基化模式分析
鉴定IgG4 HT患者TgAb IgG4的N-糖基化模式。
混合IgG4 HT患者血清纯化TgAb IgG4，经还原、羧甲基化、胰蛋白酶消化、PNGase F去糖基化后，通过MALDI-TOF-MS分析N-聚糖结构。
IgG4去糖基化及MBL结合实验
验证IgG4与MBL的结合是否依赖于N-糖基化。
用PNGase F处理纯化IgG4获得去糖基化IgG4，通过ELISA比较IgG4与去糖基化IgG4与MBL的结合能力。
体外细胞补体激活检测
验证IgG4的糖基化是否依赖补体凝集素途径激活。
将Nthy-ori 3-1人甲状腺细胞孵育IgG4或去糖基化IgG4（含5% NHS或热灭活NHS），通过免疫荧光检测IgG4、MBL和MAC。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| IgG4纯化 | CaptureSelect™ IgG4亲和基质 | Thermo Fisher Scientific | #2942902005 |
| IgG4去糖基化 | PNGase F | New England BioLabs | P0704S |
| IgG4纯化 | 蛋白A离心柱 | Thermo Fisher Scientific | 89952 |
| ELISA | 人MBL蛋白 | -- | 10405-HNASL |
| 细胞培养 | Nthy-ori 3-1 | Procell | CL-0817 |
| 免疫组化 | 抗C1q抗体 | Abcam | ab216979 |
| 抗Bb抗体 | Quidel | A227 | |
| 抗MBL抗体 | Abcam | ab203303 | |
| 抗C3d抗体 | Abcam | ab136916 | |
| 抗C4d抗体 | Abcam | ab87424 | |
| 抗MAC抗体 | Abcam | ab55811 | |
| 抗TPO抗体 | Abcam | ab278525 | |
| 抗人IgG4抗体 | Origene | HP6025 | |
| 抗MAC抗体 | Bioss | bs-2673R | |
| 抗CD45抗体 | Abcam | ab208022 | |
| ELISA | HRP标记的抗人IgG4 | Southern Biotech | HP6025 |
| 兔抗IgG4抗体 | Abcam | ab109493 | |
| HRP标记的抗兔IgG抗体 | ZSGB-BIO | ZB-2301 | |
| 甲状腺球蛋白 | Calbiochem Merck KGaA | -- | |
| 甲状腺过氧化物酶 | Diarect AG | -- | |
| 质谱分析 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| PNGase F | New England BioLabs | -- | |
| Sep-Pak C18 96孔板 | -- | -- | |
| Axima MALDI共振质谱仪 | Shimadzu | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本收集 | 验证纳入标准：IgG4 HT和非IgG4 HT分组基于免疫组化染色，甲状腺组织来源为2011-2013年间手术切除样本。 阅读提示：Methods：Patient selection |
| 血清IgG4抗体检测 | 抗原包被浓度（Tg 4 μg/mL，TPO 2 μg/mL）、抗体稀释度（TgAb IgG4 1:5000，TPOAb IgG4 1:1000）及孵育时间30分钟 阅读提示：Methods：Detection of serum TgAb IgG4 and TPOAb IgG4 |
| 免疫组化 | 一抗的稀释度及生产商：C1q (1:100, Abcam), Bb (1:30, Quidel), MBL (1:100, Abcam), C3d (1:100, Abcam), C4d (1:100, Abcam), MAC (1:250, Abcam) 阅读提示：Methods：Immunohistochemistry and immunofluorescence of thyroid tissues |
| 动物实验 | 小鼠品系（新生C57/6J <24h）、注射剂量（10 mg/g体重）、注射体积（50 μL）、观察时间（24小时） 阅读提示：Methods：Animal model |
| IgG4糖基化分析 | 混合血清样本（18例患者）、PNGase F消化条件（37°C，24h）、质谱仪型号（Shimadzu Axima） 阅读提示：Methods：Glycosylation analysis of TgAb IgG4 |
| IgG4去糖基化及MBL结合实验 | IgG4浓度（1 μg/μL）、PNGase F体积比（20:1）、孵育时间（2h）、ELISA条件（MBL包被4 μg/mL，IgG4 5 μg/mL） 阅读提示：Methods：IgG4 deglycosylation, MBL-IgG4 ELISA |
| 细胞实验 | 细胞系（Nthy-ori 3-1）、IgG4浓度（100 μg/mL）、处理时间（1h）、补体来源（5% NHS或热灭活NHS） 阅读提示：Methods：Cell immunofluorescence after IgG4 stimulation |