临床样本中circMTO1和miR-30c-5p表达检测
验证circMTO1和miR-30c-5p在OSF组织中的差异表达及其相关性
收集OSF组织和正常黏膜组织，通过RT-qPCR检测circMTO1和miR-30c-5p水平，并进行Pearson相关性分析。
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circMTO1/miR-30c-5p/SOCS3轴通过抑制成纤维细胞-肌成纤维细胞转化缓解口腔黏膜下纤维化
circMTO1/miR-30c-5p/SOCS3 axis alleviates oral submucous fibrosis through inhibiting fibroblast-myofibroblast transition
实验完整度
中包含临床样本检测、细胞功能实验（迁移、侵袭）、分子机制验证（双荧光素酶、RIP、RNA pull-down、FISH）及抑制剂回复实验，但缺乏体内动物模型验证。
主要模型
口腔黏膜下纤维化组织（n=20）和正常黏膜组织（n=20） 槟榔碱刺激的颊黏膜成纤维细胞（BMFs） 293T细胞（用于双荧光素酶报告实验）
重点核对
临床样本：OSF组织和正常黏膜组织各20例，来源为湖南湘雅口腔医院，收集时间2019年6月至2021年3月 细胞处理：BMFs暴露于槟榔碱（20μg/mL）24小时 抑制剂处理：TAE226（1μM）或LY294002（20μM） circMTO1过表达或敲低，以及miR-30c-5p mimics或inhibitor的转染 双荧光素酶报告实验使用293T细胞，共转染WT或MUT-circMTO1/SOCS3质粒和miR-30c-5p mimics或inhibitor
摘要
背景：环状RNA已被证明参与多种疾病，但其在口腔黏膜下纤维化（OSF）——一种潜在恶性疾病中的作用仍不清楚。我们的初步实验检测了从湖南湘雅口腔医院收集的OSF组织（n=20）和正常黏膜组织（n=20）中circRNA线粒体翻译优化1同源物（circMTO1）的表达，结果显示OSF组织中circMTO1表达显著降低。因此，我们进一步探讨了circMTO1在OSF中的表达。方法：使用RT-qPCR和western blotting检测靶分子表达。使用伤口愈合和Transwell实验评估颊黏膜成纤维细胞（BMFs）的迁移和侵袭。使用双荧光素酶、RNA免疫沉淀（RIP）和RNA pull-down实验评估miR-30c-5p、circMTO1和SOCS3之间的相互作用。使用荧光原位杂交（FISH）观察circMTO1和miR-30c-5p的共定位。结果：在OSF患者和槟榔碱刺激的BMFs中，circMTO1和SOCS3表达降低，而miR-30c-5p表达升高。circMTO1的过表达有效抑制了成纤维细胞-肌成纤维细胞转化（FMT），表现为Coll I、α-SMA、Vimentin表达的增加以及BMFs迁移和侵袭功能的减弱。机制研究表明，circMTO1通过海绵吸附miR-30c-5p增强SOCS3表达，进而失活FAK/PI3K/AKT通路，从而抑制FMT。SOCS3沉默诱导的FMT可被FAK抑制剂TAE226或PI3K抑制剂LY294002逆转。结论：circMTO1/miR-30c-5p/SOCS3轴通过FAK/PI3K/AKT通路调控槟榔碱处理的BMFs中的FMT。扩大样本量和体内验证可能进一步阐明其作为OSF治疗靶点的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circMTO1在口腔黏膜下纤维化（OSF）中的表达及其在成纤维细胞-肌成纤维细胞转化（FMT）中的调控机制是什么？
- 核心机制
- circMTO1通过海绵吸附miR-30c-5p，上调SOCS3表达，进而抑制FAK/PI3K/AKT通路，从而抑制FMT。
- 主要证据
- RT-qPCR和Western blot显示circMTO1过表达降低Coll I、α-SMA和Vimentin表达，减弱迁移侵袭；双荧光素酶、RIP、RNA pull-down和FISH验证circMTO1与miR-30c-5p结合；FAK抑制剂TAE226或PI3K抑制剂LY294002逆转SOCS3沉默诱导的FMT。
- 研究意义
- 本研究揭示了circMTO1在OSF中的新病理机制，并可能为OSF的临床治疗提供潜在靶点，但需扩大样本量和体内验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circMTO1在BMFs中表达及稳定性验证
检测circMTO1在槟榔碱刺激的BMFs中的表达，并验证其环状稳定性
使用RT-qPCR检测槟榔碱刺激的BMFs中circMTO1和miR-30c-5p表达；用RNase R处理总RNA后检测circMTO1表达。
circMTO1过表达对FMT的影响
验证circMTO1过表达是否抑制槟榔碱诱导的BMFs中FMT
将pcDNA3.1-circMTO1或pcDNA3.1-NC转染至BMFs，然后用槟榔碱处理，通过伤口愈合、Transwell实验检测迁移和侵袭，通过RT-qPCR和Western blot检测Coll I、α-SMA和Vimentin表达。
circMTO1与miR-30c-5p的相互作用验证
证实circMTO1直接结合并海绵吸附miR-30c-5p
通过StarBase预测结合位点，采用双荧光素酶报告实验、RNA pull-down和FISH验证结合；检测circMTO1敲低或过表达后miR-30c-5p水平变化。
circMTO1通过miR-30c-5p抑制FMT
证明circMTO1抑制FMT是通过海绵吸附miR-30c-5p实现的
在BMFs中共转染miR-30c-5p mimics和pcDNA3.1-circMTO1（或对照），然后用槟榔碱处理，检测FMT相关指标。
SOCS3作为miR-30c-5p靶基因的验证
确认SOCS3是miR-30c-5p的直接靶基因，并检测其在OSF中的表达及相关性
通过StarBase预测结合位点，双荧光素酶报告实验和RIP验证结合；RT-qPCR检测OSF组织中SOCS3表达，并分析与circMTO1和miR-30c-5p的相关性；检测miR-30c-5p或circMTO1改变后SOCS3表达。
miR-30c-5p抑制剂通过上调SOCS3抑制FMT
验证miR-30c-5p抑制剂是否通过上调SOCS3抑制槟榔碱诱导的FMT
在BMFs中共转染sh-SOCS3和miR-30c-5p inhibitor，然后用槟榔碱处理，检测FMT指标及信号通路蛋白磷酸化。
FAK/PI3K/AKT通路在SOCS3沉默诱导FMT中的作用
验证SOCS3沉默通过激活FAK/PI3K/AKT通路促进FMT
用FAK抑制剂TAE226或PI3K抑制剂LY294002处理SOCS3沉默的BMFs，检测蛋白磷酸化、迁移、侵袭及FMT标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Solarbio | -- |
| 胎牛血清 | BI | -- | |
| 药物处理 | 槟榔碱 | Sigma-Aldrich | -- |
| 信号通路抑制 | TAE226 | MCE | -- |
| LY294002 | MCE | -- | |
| RNA提取 | TRizol RNA提取试剂盒 | Engreen | -- |
| 逆转录 | PrimescriptTM逆转录试剂 | TaKaRa | -- |
| Mir-X™ miRNA第一链合成试剂盒 | Clontech | -- | |
| RT-qPCR | SYBR Green实时PCR预混液 | SinoBio | -- |
| RNA稳定性检测 | RNase R | Epicentre | -- |
| Western blotting | 组织或细胞总蛋白提取试剂盒 | Sangon Biotech | -- |
| Coll I抗体 | Bioss | bs-7158R | |
| α-SMA抗体 | Bioss | bs-0189R | |
| SOCS3抗体 | Boster | PB0452 | |
| FAK抗体 | Bioss | bs-20735R | |
| p-FAK抗体 | Bioss | bs-3159R | |
| PI3K抗体 | Bioss | bsm-52216R | |
| p-PI3K抗体 | Bioss | bs-3332R | |
| AKT抗体 | Boster | A00024 | |
| p-AKT抗体 | Boster | BM4762 | |
| Vimentin抗体 | Bioss | bs-23063R | |
| β-actin抗体 | Boster | BA2305 | |
| 鼠抗兔IgG/HRP | Bioss | bs-0295M-HRP | |
| ECL Western blot底物试剂盒 | Abcam | -- | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 基质胶 | BD | -- | |
| 结晶紫 | Solarbio | -- | |
| 双荧光素酶报告实验 | pGL3载体 | Promega | -- |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| RNA pull-down | 链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher | -- |
| RIP | RIPA裂解液 | Bioss | -- |
| FISH | DAPI | Beyotime | -- |
| 显微镜观察 | 显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本采集 | OSF组织（n=20）和正常黏膜组织（n=20）的收集时间、医院和伦理审批号 阅读提示：Methods 2.1 Clinical sample collection |
| 细胞培养和处理 | BMFs的分离方法、培养条件（DMEM、10% FBS）、代次（3-5代）、槟榔碱浓度（20μg/mL）和时间（24小时） 阅读提示：Methods 2.2 Cell culture and treatment |
| 细胞转染或感染 | 慢病毒载体（pcDNA3.1-circMTO1、sh-circMTO1、sh-SOCS3等）的生产公司（RiboBio）、感染方法 阅读提示：Methods 2.3 Lentivirus infection |
| 信号通路抑制 | TAE226（1μM）和LY294002（20μM）的处理时间 阅读提示：Methods 2.2 Cell culture and treatment、Results 3.7 |
| 关键分子检测 | 引物序列（Table S2）、内参基因（GAPDH、U6）、抗体稀释比例和货号 阅读提示：Methods 2.4 RT-qPCR、2.6 Western blotting、Supporting Information Table S2 |