中性粒细胞分离与鉴定
获取中性粒细胞用于后续细胞膜提取，并通过表面标志物确认细胞纯度。
采用密度梯度离心法从大鼠全血中分离中性粒细胞，流式细胞术检测CD11b、CD45、RP-1表达。
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中性粒细胞来源的纳米囊泡通过靶向内皮细胞递送IL-37以减轻肾缺血再灌注损伤
Neutrophil-derived nanovesicles deliver IL-37 to mitigate renal ischemia-reperfusion injury via endothelial cell targeting
实验完整度
高包含体外细胞模型（HRGEC H/R）、体内大鼠肾IRI模型，并通过TUNEL、流式、EdU、CCK-8、管形成、qPCR、ELISA、IVIS、免疫荧光等验证功能与机制。
主要模型
人肾小球内皮细胞（HRGECs）H/R模型 SD大鼠肾缺血再灌注损伤（IRI）模型
重点核对
大鼠外周血中性粒细胞分离试剂盒（Tbdscience）及密度梯度离心分离中性粒细胞 N-MVs通过挤出法制备，挤出次数为10次，使用1 μm、500 nm、200 nm聚碳酸酯多孔膜 IL-37包载量：每100 μg N-MVs加入2%重组人IL-37蛋白（按细胞膜重量计） H/R模型：缺氧12小时（94% N2, 5% CO2, 1% O2）后复氧6小时 体内大鼠IRI模型：右肾切除2周后夹闭左肾动脉40分钟，再灌注24小时
摘要
肾缺血再灌注损伤（IRI）是急性肾损伤（AKI）的最重要原因之一。白细胞介素（IL）-37被认为是一种新型抗炎因子，可用于治疗IRI，但其应用仍受限于其低稳定性和递送效率。在本研究中，我们报道了一种新型工程化方法，可高效、简便地制备中性粒细胞膜来源的囊泡（N-MVs），其可作为递送IL-37的有前景的载体，并避免中性粒细胞来源的天然细胞外囊泡的潜在副作用。N-MVs可增强IL-37的稳定性，并通过P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）将IL-37靶向递送至IRI肾脏受损的内皮细胞。体外和体内证据表明，包裹IL-37的N-MVs（N-MV@IL-37）可抑制内皮细胞凋亡，促进内皮细胞增殖和血管生成，并减少炎症因子的产生和白细胞浸润，从而改善肾IRI。我们的研究为治疗肾IRI及其他内皮损伤相关疾病建立了一种有前景的递送载体。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 工程化中性粒细胞膜纳米囊泡（N-MVs）能否作为IL-37的递送载体，通过靶向受损内皮细胞减轻肾缺血再灌注损伤？
- 核心机制
- N-MV@IL-37通过表面PSGL-1靶向受损内皮细胞，递送IL-37，抑制内皮细胞凋亡、促进增殖和血管生成，并减少炎症因子产生和白细胞浸润，从而减轻肾IRI。
- 主要证据
- 体外HRGEC H/R模型和体内大鼠肾IRI模型中，N-MV@IL-37降低凋亡率、增加增殖和管形成能力、降低TNF、IL-6、IL-1β表达，改善肾功能和组织病理，且效果优于游离IL-37。
- 研究意义
- 研究建立了一种有前景的递送载体，用于治疗肾IRI及其他内皮损伤相关疾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
中性粒细胞膜提取与验证
去除胞内成分，获得纯化的细胞膜，以避免天然EVs的潜在促炎作用。
通过匀浆和差速离心提取细胞膜，Western blot检测ATP1A1、Pan cadherin、HSP90，qPCR检测miR-23a、miR-155。
N-MV@IL-37的制备与表征
通过挤出法将IL-37包载于N-MVs中，并验证其形态、粒径、表面标志物和包载效率。
将中性粒细胞膜与重组人IL-37混合，通过挤出器反复挤出制备N-MV@IL-37，通过TEM、NTA、Western blot、ELISA、纳米流式等表征。
体外靶向性验证
验证N-MVs和N-MV@IL-37对受损内皮细胞的靶向能力，并评估PSGL-1的作用。
在静态和流式小室条件下，PKH26标记的N-MVs/N-MV@IL-37与H/R处理的HRGECs共孵育，荧光显微镜观察摄取，并使用抗PSGL-1抗体进行阻断实验。
体内分布与靶向性验证
验证N-MVs和N-MV@IL-37在肾IRI大鼠体内的分布和肾内定位。
通过尾静脉注射PKH26标记的囊泡，活体成像和免疫荧光检测各器官分布及肾内细胞类型定位，并进行PSGL-1阻断实验。
体外功能验证
评估N-MV@IL-37对H/R损伤的HRGECs的凋亡、增殖、血管生成和炎症反应的影响。
对H/R处理的HRGECs给予N-MVs、IL-37或N-MV@IL-37处理后，检测凋亡、增殖、管形成能力和炎症因子表达。
体内功能验证
评估N-MV@IL-37对肾IRI大鼠的治疗效果。
建立大鼠肾IRI模型，给予N-MVs、IL-37或N-MV@IL-37处理后，检测肾功能、组织病理、细胞凋亡、增殖、微血管密度和炎症因子表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Thermo Scientific | 21,068,028 |
| 胎牛血清 | Thermo Scientific | 10099141C | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Scientific | 15,140,122 | |
| CO2培养箱 | Thermo Scientific | Heraeus BB 150 | |
| 中性粒细胞分离 | 大鼠外周血中性粒细胞分离试剂盒 | Tbdscience | LZS1091 |
| 细胞膜提取 | 甘露醇 | Beyotime | ST2362 |
| 蔗糖 | Beyotime | ST1670 | |
| 乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸 | Thermo Scientific | E1219 | |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（不含EDTA） | Thermo Scientific | 78,441 | |
| TEM制样 | 醋酸铀酰 | aladdin | A632356 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Vazyme | E112 | |
| SDS-PAGE上样缓冲液 | Beyotime | P0286 | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Merck | 03010040001 | |
| 发光图像分析系统 | Tanon | 5200 | |
| ATP1A1抗体 | Proteintech | 14418-1-AP | |
| Pan Cadherin抗体 | ABclonal | A18682 | |
| HSP90抗体 | Proteintech | 13171-1-AP | |
| Alix抗体 | Proteintech | 12422-1-AP | |
| TSG101抗体 | Proteintech | 28283-1-AP | |
| CD63抗体 | Proteintech | 25682-1-AP | |
| Calnexin抗体 | Proteintech | 10427-2-AP | |
| CD11b抗体 | ABclonal | A1581 | |
| PSGL-1抗体 | ABclonal | A23373 | |
| ELISA | 人IL-37 ELISA试剂盒 | ABclonal | RK00117 |
| IL-37 ELISA试剂盒 | Thermo Scientific | BMS255 | |
| 同型对照IgG抗体 | ABclonal | AC005 | |
| 免疫电镜 | PSGL-1抗体 | abcam | ab316113 |
| 胶体金偶联二抗 | Merck | G7402 | |
| 流式 | 抗PSGL-1-FITC抗体 | Bioss | bs-10253R-FITC |
| 同型对照IgG-FITC抗体 | Bioss | bs-0295P-FITC | |
| 抗IL-37-PE抗体 | Thermo Scientific | 12-7379-42 | |
| 同型对照IgG-PE抗体 | Thermo Scientific | 12-4714-82 | |
| 纳米流式 | 纳米流式分析仪 | NanoFCM | N30E |
| FlowJo软件 | FlowJo | -- | |
| NTA | NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | -- |
| Zeta电位 | Zetasizer Lab | Malvern Panalytical | -- |
| TEM | 透射电子显微镜HT7800 | Hitachi | -- |
| 碳网 | Merck | TEM-FCF300CUUA | |
| 细胞摄取 | PKH26 | Abcam | MIDI26-1KT |
| 抗TNF-α抗体 | Proteintech | 60291-1-Ig | |
| 体外动态实验 | ibidi泵系统 | ibidi | -- |
| μ-Slide I Luer小室 | ibidi | 80,176 | |
| 小管形成 | 基质胶 | Corning | 354,248 |
| 血管生成培养板 | Ibidi | 81,506 | |
| EGM-2培养基 | Lonza | -- | |
| 细胞凋亡 | TUNEL凋亡检测试剂盒 | Beyotime | C1090 |
| Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | KeyGEN | KGA108 | |
| 细胞增殖 | EdU细胞增殖试剂盒 | Beyotime | C0078 |
| 细胞活力 | 细胞计数试剂盒-8 | Beyotime | C0037 |
| RNA提取 | VeZol试剂 | Vazyme | R411 |
| cDNA合成 | 逆转录试剂盒 | Vazyme | R312 |
| qPCR | 通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q312 |
| miRNA提取 | MiPure细胞miRNA提取试剂盒 | Vazyme | RC201 |
| 逆转录 | 逆转录试剂盒（MR101） | Vazyme | MR101 |
| qPCR | miRNA通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | MQ101 |
| 动物实验 | 微动脉瘤夹 | -- | -- |
| 活体成像 | IVIS Spectrum活体成像系统 | PerkinElmer | 124262 |
| Living Image 4.5软件 | Caliper Life Sciences | -- | |
| 组织切片 | OCT包埋剂 | -- | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| 抗CD31抗体 | Abcam | ab222783 | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | Abcam | ab231303 | |
| 组织病理 | 抗PCNA抗体 | Abcam | ab92552 |
| TUNEL检测试剂盒（Roche） | Roche | -- | |
| 抗CD34抗体 | Abcam | ab81289 | |
| 白细胞浸润分析 | Liberase TM | Merck | 5401054001 |
| 脱氧核糖核酸酶 | Merck | AMPD1 | |
| eBioscience流式染色缓冲液 | Thermo Scientific | 00-4222-26 | |
| 抗CD45-PE抗体 | BD Bioscience | 554878 | |
| 流式 | 流式细胞仪 | Beckman Coulter | C40323 |
| 微板阅读器 | 微板阅读器Infinite F500 | Tecan | -- |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜Axio Imager | Zeiss | -- |
| 相衬显微镜 | 相衬显微镜TiS | Nikon | -- |
| 图像分析 | ImageJ软件 | NIH | -- |
| 统计分析 | SPSS统计软件 | IBM | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 中性粒细胞分离与鉴定 | 大鼠外周血中性粒细胞分离试剂盒型号（Tbdscience, LZS1091）；流式抗体克隆及稀释度（CD11b-FITC, CD45-PE, RP-1-PE，均为1:100） 阅读提示：Methods部分：Isolation and identification of peripheral neutrophils |
| 中性粒细胞膜提取 | 匀浆次数（50-100次）；离心参数（800×g 10min, 10,000×g 10min, 100,000×g 1h）；缓冲液成分（SB，0.5% BSA，0.5 mM EGTA，1%蛋白酶抑制剂） 阅读提示：Methods部分：Preparation of N-MV@IL-37 |
| N-MV@IL-37制备 | 挤出循环次数（10次）；挤出膜孔径（1 μm, 500 nm, 200 nm）；IL-37用量（按细胞膜重量的2%） 阅读提示：Methods部分：Preparation of N-MV@IL-37 |
| 体外H/R模型 | 缺氧条件（94% N2, 5% CO2, 1% O2）及时间（12 h）；复氧时间（6 h）；N-MVs/N-MV@IL-37剂量（15 μg） 阅读提示：Methods部分：In vitro cellular uptake of N-MVs and N-MV@IL-37 和 Effects of N-MV@IL-37 on an HRGEC model of H/R |
| 体内大鼠IRI模型 | 右肾切除与恢复期（2周）；左肾动脉夹闭时间（40 min）；再灌注时间（24 h）；药物剂量（N-MVs/N-MV@IL-37 200 μg，IL-37 4 μg） 阅读提示：Methods部分：In vivo distribution of N-MVs or N-MV@IL-37 和 Effect of N-MV@IL-37 on a rat model of renal IRI |
| PSGL-1阻断实验 | 抗PSGL-1抗体（A23373）稀释比例（1:100）及预处理时间（2h） 阅读提示：Methods部分：In vitro cellular uptake of N-MVs and N-MV@IL-37 和 In vivo distribution of N-MVs or N-MV@IL-37 |