甘草酸改善多囊卵巢综合征小鼠模型中受损的葡萄糖代谢和卵巢功能障碍

Glycyrrhizin ameliorates impaired glucose metabolism and ovarian dysfunction in a polycystic ovary syndrome mouse model

作者信息Jun-Pu Yang, Amin Ullah, Ya-Nan Su, Antonia Otoo, Enoch Appiah Adu-Gyamfi, Qian Feng, Ying-Xiong Wang, Mei-Jiao Wang, Yu-Bin Ding
PMID37115805
发布时间2023-07-11
DOI10.1093/biolre/ioad048

实验完整度

高

包含PCOS小鼠模型体内实验、KGN细胞体外实验,以及HMGB1过表达和敲低实验,功能验证和机制验证明确。

主要模型

PCOS小鼠模型(DHEA+高脂饮食诱导) KGN人颗粒细胞样肿瘤细胞系

重点核对

DHEA剂量:6 mg/100 g皮下注射 高脂饮食(60% kcal脂肪) 甘草酸给药剂量:100 mg/kg,腹腔注射,每日一次 KGN细胞HMGB1过表达或敲低后,检测TLR9、MyD88、NF-κB及GLUT4、p-AKT等蛋白和mRNA表达

摘要

本研究旨在确定高迁移率族蛋白B1抑制剂甘草酸对多囊卵巢综合征小鼠葡萄糖代谢紊乱和卵巢功能障碍的影响。我们通过脱氢表雄酮联合高脂饮食构建了多囊卵巢综合征小鼠模型。对多囊卵巢综合征小鼠腹腔注射甘草酸(100 mg/kg),研究其对体重、葡萄糖耐量、胰岛素敏感性、动情周期、激素谱、卵巢病理、糖脂代谢及某些分子机制的影响。多囊卵巢综合征小鼠中增加的囊性卵泡数量、激素紊乱、葡萄糖耐量受损和胰岛素敏感性降低均被甘草酸逆转。甘草酸还降低了多囊卵巢综合征小鼠血清和卵巢组织中升高的高迁移率族蛋白B1水平。此外,甘草酸恢复了多囊卵巢综合征小鼠中Toll样受体9、髓样分化因子88和核因子κB表达的升高以及胰岛素受体、磷酸化蛋白激酶B和葡萄糖转运蛋白4表达的降低。甘草酸可抑制多囊卵巢综合征诱导的高迁移率族蛋白B1、若干炎症标志物基因及Toll样受体9/髓样分化因子88/核因子κB通路的上调,同时抑制胰岛素受体/磷酸化蛋白激酶B/葡萄糖转运蛋白4通路。因此,甘草酸是治疗多囊卵巢综合征的一种有前景的药物。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
甘草酸能否通过抑制HMGB1改善PCOS小鼠的糖代谢紊乱和卵巢功能障碍?
核心机制
甘草酸通过抑制HMGB1及其下游TLR9/MyD88/NF-κB通路,并激活p-AKT/t-AKT-GLUT4胰岛素信号通路,从而改善PCOS相关的代谢和生殖异常。
主要证据
PCOS小鼠和KGN细胞中,甘草酸或HMGB1敲低均能降低TLR9、MyD88、NF-κB和炎症因子水平,同时升高GLUT4、p-AKT和INSR水平;甘草酸还改善了PCOS小鼠的葡萄糖耐量、胰岛素敏感性、激素水平和卵巢形态。
研究意义
作者提出甘草酸可作为治疗PCOS的潜在药物,但其在PCOS患者中的疗效仍需进一步验证。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

PCOS小鼠模型建立与分组处理

建立PCOS小鼠模型,评估甘草酸的治疗效果。

25日龄雌性C57BL/6J小鼠随机分为4组:对照组、PCOS组、PCOS+甘草酸组、PCOS+溶剂组。PCOS组皮下注射DHEA并喂高脂饮食,甘草酸组每日腹腔注射100 mg/kg甘草酸。

2

代谢表型检测

评估甘草酸对PCOS小鼠糖脂代谢的影响。

检测体重、BMI、空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR、HOMA-β,进行口服葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验,并测定血清血脂水平。

3

卵巢功能评估

评估甘草酸对PCOS小鼠卵巢形态和内分泌功能的影响。

通过阴道涂片判断动情周期,卵巢组织H&E染色进行卵泡计数,ELISA检测血清睾酮、LH、FSH水平。

4

分子机制验证

验证甘草酸对HMGB1及其相关信号通路的影响。

检测小鼠卵巢和KGN细胞中HMGB1、TLR9、MyD88、NF-κB、GLUT4、p-AKT等蛋白和mRNA表达;在KGN细胞中进行HMGB1过表达和敲低实验。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
芝麻油Acros Organics241002500
脱氢表雄酮EMD Millipore252805
二甲亚砜Sigma-AldrichD2650-100ML
甘草酸Sigma-Aldrich53956-04-0
ACCU-CHEK血糖仪Roche--
小鼠胰岛素ELISA试剂盒J&L BiologicalJL11459
睾酮ELISA试剂盒J&L BiologicalJL25196
促黄体生成素ELISA试剂盒J&L BiologicalJL10432
促卵泡激素ELISA试剂盒J&L BiologicalJL10239
高密度脂蛋白胆固醇比色法试剂盒Nanjing Jian Cheng Bioengineering InstituteA112-1-1
低密度脂蛋白胆固醇比色法试剂盒Nanjing Jian Cheng Bioengineering InstituteA113-1-1
总胆固醇比色法试剂盒Nanjing Jian Cheng Bioengineering InstituteA111-1-1
甘油三酯比色法试剂盒Nanjing Jian Cheng Bioengineering InstituteA110-1-1
HMGB1 ELISA试剂盒J&L BiologicalJL13702
免疫组织化学试剂盒ZSGB-BIOSP-9001
柠檬酸钠缓冲液(抗原修复)ZSGB-BIOZLI-9064
DAB显色试剂盒ZSGB-BIOZLI-9018
抗HMGB1抗体Sangon BiotechD260488
抗TLR9抗体Biossbs-23640R
抗NF-κB抗体Biossbs-0465R
DMEM/F12培养基SigmaD6429
胎牛血清Kang Yuan Biology20180918
青霉素/链霉素BeyotimeC0224
CCK-8试剂TargetMolC0005
酶标仪(SpectraMax iD5)Molecular Devices--
Lipo8000转染试剂BeyotimeC0533
Trizol试剂Takara Biomedical Technology9108
逆转录混合物Eastep0000418224
SYBR Green荧光染料TargetMolC0006
RIPA裂解液BeyotimeP0013B
抗GAPDH抗体GOODHEREAB-P-R001
抗HMGB1抗体Cell Signaling Technology6893
抗TLR4抗体Biossbs-20594R
抗TLR9抗体Biossbs-23640R
抗GLUT4抗体Cell Signaling Technology2213S
抗总AKT抗体Cell Signaling Technology4691
抗磷酸化AKT抗体Cell Signaling Technology4060
抗NF-κB抗体Biossbs-0465R
辣根过氧化物酶标记二抗Absin Bioscienceabs20040ss
ECL化学发光底物New Cell & Molecular BiotechP10300

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型建立与分组处理
小鼠品系、年龄、体重;DHEA剂量及注射方式;高脂饮食脂肪含量;甘草酸剂量、给药途径及频率;对照组处理(芝麻油、生理盐水)
阅读提示:Materials and methods, Treatment scheme, Figure 1A
代谢功能检测
空腹时间;葡萄糖灌胃剂量;胰岛素注射剂量;血糖测量时间点;血清胰岛素ELISA试剂盒及操作;HOMA-IR和HOMA-β计算公式
阅读提示:Materials and methods, Oral glucose tolerance test, insulin tolerance test, and glucose metabolism indexes assessment
卵巢功能评估
阴道涂片方法及染色;H&E染色切片厚度及切片数量;卵泡计数标准;激素ELISA试剂盒及检测方法
阅读提示:Materials and methods, Estrous cycle determination; Tissue processing and histological staining; Analysis of serum hormone concentrations
细胞实验:KGN细胞处理
细胞系来源;培养基成分;甘草酸处理浓度和时长;CCK-8检测步骤;转染试剂及质粒/siRNA序列
阅读提示:Materials and methods, KGN cell experiments; Cell counting kit-8 assay; Cell transfection; Supplementary Table S1
分子机制验证
Western blot抗体及稀释比例;RT-qPCR引物序列;HMGB1过表达和敲低验证方法;蛋白和mRNA表达量检测方法
阅读提示:Materials and methods, Western blot; Real-time quantitative polymerase chain reaction; Results, Figure 6 and 7