鉴定关节炎中Uhrf1表达上调
筛选关节炎中可能参与发病的表观遗传调控因子。
对CAIA小鼠踝关节组织进行全基因组表达谱分析，识别差异表达基因，并评估Uhrf1表达变化及细胞定位。
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表观遗传调控因子UHRF1以抑制性方式协调类风湿关节炎中的促炎基因表达
Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner
实验完整度
高包含SF特异性敲除小鼠模型、体外细胞实验、转录组和甲基化组测序、患者样本分析及药物干预验证等多个独立证据层级，并具备功能验证和机制验证。
主要模型
胶原抗体诱导关节炎(CAIA)小鼠 K/BxN血清转移关节炎(STA)小鼠 胶原诱导关节炎(CIA)小鼠 类风湿关节炎患者滑膜组织及滑膜成纤维细胞(RASFs) 骨关节炎患者滑膜成纤维细胞(OASFs) 类风湿关节炎患者来源的滑膜成纤维细胞3D类器官 HEK293细胞
重点核对
SF特异性Uhrf1敲除小鼠（Uhrf1ΔCol6a1）的关节炎诱导及表型评估 Uhrf1缺失SFs中Ccl20等基因表达上调的验证（RT-qPCR） Uhrf1直接结合Ccl20启动子区域的ChIP-qPCR验证 Uhrf1表达与RA患者疾病活动度（DAS28）的负相关分析 Ryuvidine处理对关节炎模型的治疗效果及其依赖Uhrf1的验证
摘要
类风湿关节炎（RA）以慢性滑膜炎症和异常表观遗传改变为特征，最终导致关节破坏。然而，RA发病机制中的表观遗传调控机制在很大程度上仍不清楚。在这里，我们展示了含有PHD和RING finger结构域的泛素样蛋白1（UHRF1）是一种中枢表观遗传调控因子，以抑制性方式协调RA中的多种病理过程。在关节炎模型小鼠和RA患者的滑膜成纤维细胞（SFs）中，UHRF1表达显著上调。SFs特异性Uhrf1条件敲除小鼠表现出比同窝对照更严重的关节炎表型。Uhrf1缺陷的SFs还表现出增强的凋亡抵抗和多个细胞因子（包括Ccl20）的表达上调。在RA患者中，DAS28、CRP、Th17细胞积聚和凋亡抵抗与滑膜中UHRF1表达呈负相关。最后，Ryuvidine给药稳定了UHRF1，改善了RA小鼠模型中的关节炎病理。这项研究表明，RA SFs中表达的UHRF1可以促进负反馈机制，抑制关节炎中的多个致病事件，提示靶向UHRF1可能是RA的治疗策略之一。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探讨表观遗传调控因子UHRF1在类风湿关节炎发病机制中的作用及其作为治疗靶点的潜力。
- 核心机制
- UHRF1通过调控DNA甲基化直接抑制滑膜成纤维细胞中多种RA加重因子（如Ccl20）的表达，从而发挥抑制性作用；其缺失导致这些基因上调，促进Th17细胞募集和凋亡抵抗，加重关节炎。
- 主要证据
- 在关节炎模型小鼠和RA患者中均观察到UHRF1表达上调；SF特异性Uhrf1敲除小鼠关节炎加重，SFs凋亡抵抗增强且Ccl20等表达升高；RNA-Seq和MBD-Seq分析鉴定出UHRF1调控的靶基因；ChIP-qPCR证实UHRF1直接结合Ccl20位点；患者样本中UHRF1表达与DAS28呈负相关；Ryuvidine稳定UHRF1可改善关节炎。
- 研究意义
- 本研究揭示了UHRF1在RA中的负反馈调控作用，提示靶向UHRF1稳定性可能成为RA的潜在治疗策略，尤其为对现有治疗反应不佳的患者提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SF特异性Uhrf1敲除对关节炎的影响
验证SF中Uhrf1对关节炎病理的功能作用。
建立SF特异性Uhrf1敲除小鼠，诱导关节炎，评估临床评分、组织病理、细胞增殖和凋亡。
Uhrf1依赖的基因表达变化分析
鉴定Uhrf1缺失时SFs中表达改变的基因及通路。
对Uhrf1fl/fl和Uhrf1ΔCol6a1 SFs进行RNA-Seq，分析差异表达基因及富集通路。
Uhrf1调控DNA甲基化的机制分析
揭示Uhrf1通过DNA甲基化调控靶基因表达的机制。
利用MBD-Seq分析Uhrf1介导的甲基化位点，整合转录组数据鉴定靶基因，并通过ChIP-qPCR验证Uhrf1直接结合。
临床样本中UHRF1表达的验证
验证UHRF1表达与RA疾病严重程度的相关性。
检测RA和OA滑膜中UHRF1 mRNA和蛋白水平，并分析其与临床参数的相关性。
UHRF1在RASFs中的功能验证
验证UHRF1对人类滑膜成纤维细胞中CCL20表达和凋亡的影响。
在OASFs和RASFs中敲低UHRF1，检测CCL20表达和凋亡抵抗，并分析与Th17细胞比例的相关性。
Ryuvidine对关节炎的治疗效果
评估UHRF1稳定剂Ryuvidine对关节炎的治疗潜力。
在STA和CIA模型中给予Ryuvidine，评估关节炎严重程度及组织学变化，并利用RASF类器官验证其对滑膜增生的抑制作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | 抗UHRF1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-373750 |
| 抗UHRF1抗体 | Abcam | ab194236 | |
| 抗Pdpn抗体 | Wako | 015-24111 | |
| 抗PDPN抗体 | BioLegend | 916606 | |
| 抗Fap抗体 | R&D Systems | MAB9727 | |
| 抗FAP抗体 | Bioss | bs-5758R | |
| 抗Thy-1抗体 | Cell Signaling Technology | 13801 | |
| 抗CD45抗体 | Abcam | ab10558 | |
| 抗CD45抗体 | BioLegend | 304002 | |
| 抗F4/80抗体 | Cell Signaling Technology | 70076 | |
| 抗CD3抗体 | Bio-Rad | MCA1477T | |
| 抗GFP抗体 | Cell Signaling Technology | 598 | |
| 抗裂解caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 抗Ki-67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| 抗β-actin抗体 | MBL | M177-3 | |
| Alexa Fluor 488标记抗大鼠IgG | Molecular Probes | -- | |
| Alexa Fluor 488标记抗兔IgG | Molecular Probes | -- | |
| Alexa Fluor 568标记抗小鼠IgG1 | Molecular Probes | -- | |
| Alexa Fluor 568标记抗大鼠IgG | Molecular Probes | -- | |
| Alexa Fluor 568标记抗兔IgG | Molecular Probes | -- | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG | DAKO | -- | |
| 流式细胞术 | FITC标记抗小鼠CD45 | BioLegend | 30-F11 |
| PE标记抗小鼠CD4 | BioLegend | GK1.5 | |
| Alexa Fluor 647标记抗小鼠Ccr6 | BD Biosciences | 140706 | |
| APC标记抗人CD45 | Miltenyi Biotec | 5B1 | |
| FITC标记抗人CD4 | BioLegend | OKT4 | |
| PE标记抗人CCR6 | BioLegend | G034E3 | |
| 凋亡诱导 | 抗人FAS抗体 | MBL | CH-11 |
| 细胞培养 | IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| DMEM GlutaMax培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗生素-抗真菌溶液 | Gibco | -- | |
| 40 μm细胞筛网 | Falcon | -- | |
| I型胶原蛋白C | Nitta gelatin | -- | |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 聚-HEMA | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞处理 | 重组小鼠TNF-α | -- | -- |
| 蚜栖菌素 | -- | -- | |
| 诺考达唑 | -- | -- | |
| 药物处理 | Ryuvidine | Cayman Chemical | -- |
| UNC0379 | Cayman Chemical | -- | |
| NSC663284 | Cayman Chemical | -- | |
| BVT948 | Cayman Chemical | -- | |
| 关节炎诱导 | 抗II型胶原抗体混合物 | Chondrex | -- |
| 脂多糖 | -- | -- | |
| 鸡II型胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 完全弗氏佐剂 | -- | -- | |
| 不完全弗氏佐剂 | -- | -- | |
| 组织处理 | TRAP染色试剂盒 | Wako | -- |
| 免疫荧光 | 免疫抗原修复液 | Wako | -- |
| 组织封闭液 | Nacalai Tesque | -- | |
| 抗体增强液 | -- | -- | |
| Alexa Fluor 488标记鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TUNEL | TUNEL试剂盒 | Roche | -- |
| 流式细胞术 | FACSAria流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| Gallios流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| FlowJo软件 | Treestar Inc. | -- | |
| qPCR | Isogen试剂 | Nippon Gene | -- |
| RNeasy离心柱试剂盒 | Qiagen | -- | |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara Bio | -- | |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara Bio | -- | |
| Thermal Cycler Dice | Takara Bio | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Nacalai Tesque | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL prime检测试剂 | GE Healthcare | -- | |
| ImageQuant LAS 4000成像系统 | GE Healthcare | -- | |
| siRNA转染 | UHRF1 siRNA | Thermo Fisher Scientific | -- |
| MISSION siRNA通用阴性对照 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Neon电穿孔系统 | Invitrogen | -- | |
| Lipofectamine RNAiMax转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ELISA | 小鼠Ccl20 ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| FluxStation3酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| ChIP | ChIP-IT高灵敏度试剂盒 | Active Motif | -- |
| Covaris S220超声仪 | Covaris | -- | |
| 正常小鼠IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2343 | |
| Microarray | GeneChip小鼠基因组430 2.0芯片 | Affymetrix | -- |
| RNA-Seq | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| Illumina TruSeq链特异性mRNA LT样品制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| MiSeq测序系统 | Illumina | -- | |
| MiSeq试剂盒V3 150循环 | Illumina | -- | |
| MBD-Seq | EpiXplore甲基化DNA富集试剂盒 | Takara Bio | -- |
| Quantus荧光计 | Promega | -- | |
| QIAseq超低起始量文库制备试剂盒 | Qiagen | -- | |
| TapeStation系统 | Agilent | -- | |
| Agilent高灵敏度D1000 ScreenTape试剂盒 | Agilent | -- | |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | -- | |
| Microarray | SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | -- |
| MinElute反应纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| BioArray HighYield RNA转录标记试剂盒 | Enzo Life Sciences | -- | |
| GeneChip操作软件 | Affymetrix | -- | |
| 组织切片 | RM2255切片机 | Leica Biosystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 关节炎模型诱导 | 小鼠品系、性别、年龄、诱导方法（CAIA、K/BxN STA、CIA）、血清或抗体剂量、注射途径、时间点。 阅读提示：详见Methods中“Arthritis model mice studies”及图1A、图2A-B、图8B。 |
| SF特异性Uhrf1敲除小鼠 | Uhrf1fl/fl小鼠的构建方法、Cre品系（Col6a1-Cre）、基因型鉴定、关节炎诱导后的表型评估。 阅读提示：详见Methods中“Mice”及图2A-E。 |
| 体外细胞实验 | 原代SF和滑膜巨噬细胞的分离方法、培养条件、传代数、细胞处理浓度和时间（如Tnf-α、CHX、抗FAS抗体）。 阅读提示：详见Methods中“Murine synovial cell studies”及图1I、图2H、图7D-E。 |
| 基因表达分析 | RNA提取方法、RT-qPCR引物序列、内参基因（RPLP0）、RNA-Seq文库制备流程和测序平台。 阅读提示：详见Methods中“Real time RT-PCR”、“RNA-Seq analysis”及图1F、图5G-H。 |
| 表观遗传分析 | MBD-Seq实验步骤、富集DNA片段大小、peak calling参数、ChIP-qPCR抗体和引物信息。 阅读提示：详见Methods中“MBD-Seq analysis”、“ChIP assay”及图5A-I。 |
| 患者样本分析 | 患者纳入标准、滑膜组织收集方式、RNA和蛋白提取方法、临床参数（DAS28、CRP）记录、样本量。 阅读提示：详见Methods中“Human synovial specimens”及图6A-D。 |
| 药物处理 | Ryuvidine的给药剂量（0.8 μg/g）、溶剂（DMSO和玉米油）、给药时间点和途径。 阅读提示：详见Methods中“Arthritis model mice studies”及图8B-I。 |