患者队列临床特征和基因突变鉴定
鉴定DGAT1突变并描述患者临床表现，建立基因型-表型关联。
收集10名来自6个家系的DGAT1缺乏症患者，进行全外显子测序、靶向panel测序和Sanger测序，鉴定出5个新的DGAT1纯合突变。详细记录了患者的临床表现、治疗和转归。
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DGAT1缺乏症患者的肠道衰竭和异常脂质代谢
Intestinal Failure and Aberrant Lipid Metabolism in Patients With DGAT1 Deficiency
实验完整度
高包含患者队列基因突变鉴定、患者来源类器官及成纤维细胞模型、CRISPR/Cas9基因敲除验证、DGAT1/DGAT2回补实验、脂质代谢检测及脂毒性功能实验，多个独立证据层级且包含功能验证。
主要模型
患者来源肠道类器官 患者来源真皮成纤维细胞 CRISPR/Cas9敲除DGAT1的肠道类器官 Caco-2细胞
重点核对
患者来源类器官和成纤维细胞中DGAT1蛋白表达水平 油酸（OA）处理浓度及时间（1 mM OA/BSA，17小时） DGAT1抑制剂AZD 3988浓度（0.1 μM） 脂滴形成检测方法（LD540染色、Nile Red染色、SSC-A） 脂毒性检测中油酸浓度梯度（0-6 mM）及细胞死亡评估
摘要
背景与目的：先天性腹泻病（CDD）是罕见的遗传性肠道疾病，其特征是顽固性、有时危及生命的腹泻和营养吸收不良；其中一些与二酰甘油酰基转移酶1（DGAT1）的突变有关，该酶催化二酰甘油和酰基辅酶A生成三酰甘油。我们利用患者来源的类器官研究了DGAT1缺乏导致肠道衰竭的机制。方法：我们收集了来自6个无关家系的10名患者的血液样本，这些患者表现为早发性严重腹泻和/或呕吐、低白蛋白血症和/或（致死性）蛋白丢失性肠病伴肠道衰竭；我们对其中8名患者的DNA进行了下一代测序分析。从3名患者和3名健康对照者（对照）的十二指肠活检组织中生成了类器官。用表达全长或突变型DGAT1或全长DGAT2的载体转染或转导Caco-2细胞和患者来源的真皮成纤维细胞。我们在对照肠道类器官中进行了CRISPR/Cas9介导的DGAT1破坏。通过免疫印迹、免疫荧光、流式细胞术、色谱法、实时定量聚合酶链反应以及caspase 3和7活性对细胞和类器官进行了分析。结果：在这10名患者中，我们鉴定了DGAT1中的5个双等位基因功能缺失突变。在患者来源的成纤维细胞和类器官中，这些突变降低了DGAT1蛋白的表达并改变了三酰甘油代谢，导致油酸添加后脂滴形成减少。在患者来源的成纤维细胞中表达全长DGAT2可恢复脂滴的形成。与对照类器官相比，来自DGAT1突变患者的类器官更容易发生脂质诱导的细胞死亡。结论：我们确定了一个大的先天性腹泻病患者队列，这些患者携带DGAT1突变，该突变导致其产物表达减少；来自这些患者的真皮成纤维细胞和肠道类器官表现出脂质代谢改变，并易发生脂质诱导的细胞死亡。在这些细胞中表达全长野生型DGAT1或DGAT2可恢复正常的脂质代谢。这些发现表明DGAT1在肠上皮脂肪代谢和脂毒性中的重要性。无脂肪饮食可能作为DGAT1表达降低患者的一线治疗。识别与先天性腹泻病相关的遗传变异对于正确诊断和治疗策略的选择非常重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DGAT1缺乏如何导致肠道衰竭和蛋白丢失性肠病？
- 核心机制
- DGAT1功能缺失导致肠上皮细胞三酰甘油合成受阻，脂滴形成减少，使细胞对脂质诱导的细胞死亡（脂毒性）更敏感，从而引发肠道损伤和蛋白丢失。
- 主要证据
- 患者来源类器官和成纤维细胞在油酸刺激下脂滴形成减少，DGAT1敲除类器官表型一致；DGAT1或DGAT2回补可恢复脂滴形成。DGAT1缺陷类器官在较低油酸浓度下即发生细胞死亡。
- 研究意义
- 该研究强调了识别先天性腹泻病患者遗传缺陷的重要性，并展示了肠道类器官技术在研究罕见胃肠道疾病中的应用；提示无脂肪饮食可作为DGAT1表达降低患者的一线治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DGAT1突变对蛋白表达的影响
验证不同DGAT1突变是否导致蛋白表达异常。
通过免疫组化、Western blot和RT-PCR分析患者来源的活检组织、成纤维细胞、B-LCL和肠道类器官中的DGAT1蛋白和mRNA表达。
DGAT1缺失对脂质代谢的影响
探究DGAT1缺失是否导致脂滴形成和三酰甘油合成异常。
对患者来源类器官、成纤维细胞和CRISPR/Cas9敲除DGAT1的类器官进行油酸刺激，通过LD540和Nile Red染色及流式细胞术检测脂滴形成；通过薄层色谱检测三酰甘油和二酰甘油水平。
DGAT1或DGAT2回补实验
验证外源性DGAT1或DGAT2能否挽救DGAT1缺乏引起的脂质代谢异常。
用逆转录病毒载体在患者3来源的成纤维细胞中表达野生型DGAT1或DGAT2，检测脂滴形成是否恢复。
脂毒性敏感性评估
检验DGAT1缺乏是否增加细胞对脂质诱导的死亡敏感性。
用不同浓度油酸处理健康对照和患者来源类器官，通过碘化丙啶染色和Caspase-Glo 3/7实验评估细胞死亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良 Eagle 培养基 | Life Technologies | -- |
| GlutaMax | Life Technologies | -- | |
| 胎牛血清 | GE Health Care | -- | |
| 青霉素 | Gibco | -- | |
| 链霉素 | Gibco | -- | |
| RPMI 1640 培养基 | -- | -- | |
| 脂滴检测 | 油酸 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| DGAT1抑制剂AZD 3988 | Tocris | -- | |
| LD540 染料 | -- | -- | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | -- | |
| 流式细胞术 | TrypLE Express 消化液 | ThermoFisher | -- |
| BD FACS Canto II 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 脂滴检测 | 脂滴荧光检测试剂盒 | Cayman Chemical | 500001 |
| 流式细胞术 | BD FACS Fortessa 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 基因克隆 | pDONR221 载体 | Thermo Fisher | -- |
| pFMIG 载体 | -- | -- | |
| 实时定量PCR | iScript cDNA 合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| SYBR green 超混液 | Bio-Rad | -- | |
| Light Cycler96 实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| RNeasy Mini 试剂盒 | Qiagen | -- | |
| TRIzol LS 试剂 | Invitrogen | -- | |
| Western blot | MG132 | Cayman Chemicals | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Merck Millipore | -- | |
| LI-COR Odyssey 成像系统 | LI-COR | -- | |
| 抗Flag M2抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| 抗DGAT1抗体 | Abcam | ab181180 | |
| 抗DGAT1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32861 | |
| 抗DGAT2抗体 | Bioss Antibodies | bs-12998R | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| 抗HA-HRP偶联物 | Sigma-Aldrich | H6533 | |
| 抗HSP90抗体 | -- | -- | |
| 驴抗小鼠IgG IRDye 680 | LI-COR | 926-32222 | |
| 驴抗兔IgG IRDye 680RD | LI-COR | 926-68073 | |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP | BD Biosciences | 554002 | |
| 山羊抗兔IgG-HRP | Bio-Rad | 172-1019 | |
| 薄层色谱 | 铝背硅胶板 | Merck Millipore | -- |
| 1,3-二戊adecanoin | -- | -- | |
| 三戊adecanoin | -- | -- | |
| 三庚adecanoin | -- | -- | |
| 脂毒性检测 | Hoechst 染料 | Sigma-Aldrich | -- |
| 碘化丙啶 | ThermoFisher | -- | |
| Caspase-Glo 3/7 检测试剂盒 | Promega | -- | |
| Tristar 2 发光检测仪 | Berthold Technologies | -- | |
| 免疫组织化学 | Lab Vision UltraVision LP 检测系统 | Thermo Scientific | TL-060-HL |
| 抗DGAT1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | H-255 | |
| 类器官培养 | 基质胶 | Corning | -- |
| 小鼠表皮生长因子 | PeproTech | -- | |
| 烟酰胺 | Sigma | -- | |
| N-乙酰 | Sigma | -- | |
| B27 补充剂 | Gibco | -- | |
| TGF-α抑制剂A83-01 | Tocris | -- | |
| P38抑制剂SB202190 | Sigma | -- | |
| Primocin 抗生素 | InvivoGen | -- | |
| Y-27632 ROCK抑制剂 | Abcam | -- | |
| CRISPR/Cas9 | pSpCas9(BB) 载体 | Addgene | PX459 |
| CHIR99021 | -- | -- | |
| BTXpress 缓冲液 | BTX Genetronics | -- | |
| NEPA21 电穿孔仪 | -- | -- | |
| 潮霉素B | Invitrogen | -- | |
| 逆转录PCR | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| Qiagen RNAeasy mini 试剂盒 | Qiagen | -- | |
| M-MLV 逆转录酶 | Promega | -- | |
| GoTaq 聚合酶 | Promega | -- | |
| Microcon 离心过滤器 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA 裂解缓冲液 | -- | -- |
| Lowry 蛋白定量法 | -- | -- | |
| Bradford 蛋白定量法 | -- | -- | |
| 脂滴检测 | Leica SP8X 激光扫描共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 脂毒性检测 | Olympus IX53 荧光显微镜 | Olympus | -- |
| 平行实验 | 黑色透明底96孔成像板 | Corning Life Sciences | -- |
| TC处理96孔板 | Greiner | -- | |
| 白壁96孔板 | Greiner | -- | |
| 细胞培养 | 6孔板 | -- | -- |
| 24孔板 | Corning | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 类器官培养 | 培养基成分（hSI-EM），生长因子（Wnt、Rspondin-1、Noggin、EGF），小分子抑制剂（A83-01、SB202190），基质胶浓度（70%），培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Supplementary Materials and Methods 中的 Cell Culture |
| CRISPR/Cas9基因敲除 | sgRNA序列（sgRNA#2、#6、#7、#8），转染条件（电穿孔，1×10^6细胞），质粒浓度（1 μg/μL），筛选药物（Hygromycin B 100 μg/mL） 阅读提示：Materials and Methods 中的 CRISPR/Cas9 Knockout of DGAT1 和 Supplementary Materials and Methods |
| 脂滴检测 | OA/BSA制备方法，处理浓度（1 mM OA），处理时间（17小时），DGAT1抑制剂浓度（0.1 μM），染色浓度（LD540 0.025 mg/mL，DAPI） 阅读提示：Materials and Methods 中的 Lipid Droplet Assays |
| 脂毒性检测 | OA浓度梯度，处理时间（过夜），检测方法（碘化丙啶染色、Caspase-Glo 3/7实验），细胞死亡评估标准 阅读提示：Materials and Methods 中的 Lipotoxicity Assays |
| 薄层色谱 | Folch提取方法，溶剂体系（正己烷:乙醚:乙酸=60:15:2），显色方法（CuSO4/H2SO4），TG/DG定量方法 阅读提示：Materials and Methods 中的 Thin Layer Chromatography |