样本收集与基因组分析
鉴定幕上室管膜瘤中的复发性基因融合事件
对41个肿瘤进行全基因组测序，对77个肿瘤进行转录组测序，并对89个FFPE样本进行FISH和RT-PCR验证，分析结构变异和融合转录本。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
C11orf95-RELA融合驱动室管膜瘤中的致癌性NF-κB信号传导
C11orf95-RELA fusions drive oncogenic NF-κB signalling in ependymoma
实验完整度
高包含全基因组测序、RNA测序、FISH、RT-PCR、Western blot、报告基因实验、神经干细胞转化及小鼠移植瘤模型等多层级验证。
主要模型
人幕上室管膜瘤肿瘤样本 小鼠神经干细胞（NSC） 293T细胞 CD1-裸鼠颅内移植瘤模型
重点核对
C11orf95-RELA融合断点及融合转录本序列（WGS和RNAseq） 融合蛋白在细胞核的定位及NF-κB转录活性（报告基因实验） 神经干细胞转化及体内成瘤能力（小鼠移植瘤模型） 肿瘤组织中NF-κB靶基因（CCND1、L1CAM）和磷酸化RELA的表达
摘要
核因子-κB（NF-κB）转录调节因子家族是细胞炎症反应的核心介导因子。尽管大多数人类肿瘤中存在组成性NF-κB信号传导，但通路成员的突变较为罕见，这使得理解和阻断癌症中异常NF-κB活性变得困难。在此，我们显示超过三分之二的幕上室管膜瘤包含RELA（经典NF-κB信号传导的主要效应因子）与一个未表征基因C11orf95之间的致癌融合。在每种情况下，C11orf95-RELA融合均由涉及染色体11q13.1的染色体破碎引起。C11orf95-RELA融合蛋白自发转位至细胞核，激活NF-κB靶基因，并快速转化神经干细胞（室管膜瘤的起源细胞），在小鼠中形成这些肿瘤。我们的数据确定了人类癌症中RELA的第一个高频复发性遗传改变，并确定C11orf95-RELA融合蛋白作为幕上室管膜瘤的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 幕上室管膜瘤中是否存在高频复发的致癌性基因融合，以及该融合如何驱动肿瘤发生？
- 核心机制
- C11orf95-RELA融合蛋白自发转位至细胞核，组成性激活NF-κB信号通路，上调NF-κB靶基因，从而驱动神经干细胞转化和肿瘤形成。
- 主要证据
- 全基因组测序和RNA测序发现C11orf95-RELA融合，体外实验证实融合蛋白核定位并激活NF-κB，神经干细胞移植小鼠形成肿瘤，且肿瘤表达NF-κB靶基因CCND1和L1CAM。
- 研究意义
- 该研究确定了人类癌症中RELA的第一个高频复发性遗传改变，表明C11orf95-RELA融合蛋白是幕上室管膜瘤的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
C11orf95-RELA融合验证
验证融合事件的存在及融合转录本的表达
使用定制捕获阵列、RT-PCR和Sanger测序、FISH和Western blot验证融合DNA和RNA。
融合蛋白功能分析
评估C11orf95-RELA融合蛋白的亚细胞定位和转录活性
在293T细胞中过表达C11orf95、RELAWT或RELAFUS1，通过核质分离和报告基因实验检测蛋白定位和NF-κB活性。
神经干细胞转化实验
测试RELA融合蛋白的转化能力
从Ink4a/Arfnull Blbp-eGFP小鼠分离神经干细胞，用携带C11orf95-RFP、RELAWT-RFP、RELAFUS1-RFP或RELAFUS2-RFP的逆转录病毒感染，植入免疫缺陷小鼠脑内，观察肿瘤形成。
肿瘤转录组分析
比较RELAFUS1肿瘤与EPHB2肿瘤的基因表达谱，评估NF-κB通路激活
使用Affymetrix微阵列对小鼠肿瘤和NSC进行表达谱分析，使用IPA分析NF-κB通路激活。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA/RNA提取 | Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | -- |
| 逆转录PCR | SuperScript VILO | Life Technologies | -- |
| iScript cDNA合成系统 | Bio-Rad | -- | |
| PCR扩增 | GoTaq Long PCR预混液 | Promega | -- |
| 免疫组化 | p-NF-κB p65抗体（Ser276） | Bioss | bs-3543R |
| Ultravision Plus检测系统 | Thermo Scientific | -- | |
| 抗L1CAM抗体 | Sigma-Aldrich | L4543 | |
| Novocastra Bond聚合物精制检测试剂盒 | Leica Microsystems | -- | |
| 抗CCND1抗体 | Cell Marque | 241R-18 | |
| ultraView通用DAB检测试剂盒 | Ventana | -- | |
| Western blot | NF-κB p65抗体 | Abcam | ab32536 |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 4282 | |
| Lamin B1抗体 | Abcam | ab16048 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| Millipore GAPDH抗体 | Millipore | 374 | |
| 细胞培养 | 293T细胞 | ATCC | CRL-11268 |
| 报告基因分析 | LSR II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| RNA提取 | TRIzol | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad | -- |
| 克隆 | In-Fusion HD EcoDry克隆Plus系统 | Clontech | -- |
| 病毒浓缩 | Centricon Plus-70 | Millipore | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因组分析 | 样本量（41 WGS，77 RNAseq）、测序平台和覆盖深度 阅读提示：Methods: Next Generation Sequencing |
| 融合验证 | FISH探针序列、RT-PCR引物、Western blot抗体 阅读提示：Methods: Fluorescence in situ Hybridization, RT-PCR, Western Blot Analysis |
| 细胞功能实验 | 细胞系（293T）、转染量（6μg报告质粒）、TNF浓度（5-50ng/ml）和刺激时间（6-8小时） 阅读提示：Methods: Promoter transactivation Reporter assays, Fractionation of Nuclear and Cytoplasmic extracts |
| 神经干细胞转化 | 小鼠品系（Ink4a/Arfnull Blbp-eGFP）、细胞数量（1.5x10^6）、植入位置（脑内） 阅读提示：Methods: Cloning and Retroviral Production, 以及主文中关于细胞植入的描述 |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系（CD1-裸鼠）、性别和年龄（雌性，6周龄）、每组数量（15只） 阅读提示：Methods: 主文中C11orf95-RELA drives ependymoma部分 |