药物筛选
从临床批准药物文库中鉴定能抑制IFN-I产生的化合物
使用THP1-Blue ISG细胞和PBMCs，在R848、2'3'-cGAMP或IFN-I刺激下，用Prestwick化学文库中的化合物处理，检测IFN-I报告基因活性和细胞活力，计算抑制效果。
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鉴定靶向系统性红斑狼疮中I型干扰素和B细胞异常的组蛋白去乙酰化酶抑制剂
Identification of Histone Deacetylase Inhibitor Targeting Type I Interferon and B Cell Abnormalities in Systemic Lupus Erythematosus
实验完整度
高包含体外筛选、细胞功能实验（IFN-I产生、B细胞分化）、体内动物模型（SAVI小鼠、NZB/W F1小鼠）及机制验证（通路蛋白磷酸化、转录因子表达），证据层级多元。
主要模型
THP1-Blue ISG细胞 人外周血单个核细胞（PBMCs） 人B细胞 SAVI N153S小鼠 NZB/W F1小鼠
重点核对
vorinostat浓度（0.25-100 μM） 刺激物及浓度：LPS（500 ng/mL）、2'3'-cGAMP（5 μg/mL）、R848（5 μg/mL） 给药方案：20 mg/kg腹腔注射每周5次持续16周（NZB/W F1小鼠），20 mg/kg每日一次持续8周（SAVI小鼠） 检测指标：IFN-I活性（SEAP或HEK-Blue报告基因）、TBK1/IRF3磷酸化、IRF3核转位、浆细胞分化（流式）、IgG和抗dsDNA抗体水平、蛋白尿、肾小球肾炎评分、存活率
摘要
目的：系统性红斑狼疮（SLE）的特征是I型干扰素（IFN‐I）和自身抗体产生增加。本研究旨在鉴定能够同时抑制IFN‐I和自身抗体产生的药物。方法：我们从化学文库中鉴定了一种IFN‐I产生的抑制剂。随后，我们检测了其抑制IFN‐I产生的上游信号分子的表达和磷酸化以及B细胞向浆细胞分化的功效和潜在机制。此外，我们检测了其是否能减轻SLE易感小鼠的疾病严重程度。结果：我们发现，临床批准的泛组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂伏立诺他（vorinostat）抑制了IFN‐I的产生和浆细胞分化。伏立诺他通过抑制TBK1磷酸化及随后的IRF3核转位来抑制IFN‐I产生，并通过抑制浆细胞必需转录因子的表达来抑制浆细胞分化。值得注意的是，抑制HDAC6抑制了IFN‐I的诱导和浆细胞分化。此外，伏立诺他通过降低IFN‐I改善了STING相关婴儿期起病血管病变小鼠的肺部炎症，并通过抑制IFN‐I诱导和B细胞分化减轻了新西兰黑/白F1小鼠的死亡率和肾疾病严重程度。结论：伏立诺他通过靶向HDAC6同时抑制IFN‐I产生和浆细胞分化，从而减轻SLE易感小鼠的疾病严重程度。因此，伏立诺他是治疗SLE的一种有前景的治疗药物，可能使需要更有效且耐受性更好的治疗的SLE患者受益。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 寻找能同时抑制IFN-I产生和自身抗体产生的药物，并验证其对SLE的治疗效果。
- 核心机制
- 伏立诺他通过抑制HDAC6，抑制TBK1磷酸化及IRF3核转位，下调IRF5、IRF7、IRF9等表达，从而抑制IFN-I产生；同时抑制B细胞向浆细胞分化所需转录因子Prdm1、XBP1、IRF4的表达，从而抑制浆细胞分化和自身抗体产生。
- 主要证据
- 体外实验显示伏立诺他抑制IFN-I产生和浆细胞分化；在SAVI小鼠中降低肺部炎症和IFN-I水平；在NZB/W F1小鼠中提高生存率、减轻蛋白尿和肾小球肾炎，并降低血清IFN-I、抗dsDNA抗体和免疫复合物沉积。
- 研究意义
- 伏立诺他作为临床已批准的药物，可能成为SLE的一种有前景的治疗选择，尤其对需要更有效且耐受性更好的治疗的患者。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外IFN-I产生抑制实验
验证vorinostat对IFN-I产生的抑制作用
THP1-Blue ISG细胞和PBMCs用vorinostat预处理，然后加入LPS、2'3'-cGAMP或R848刺激，检测IFN-I活性。
机制研究：TBK1/IRF3信号通路
阐明vorinostat抑制IFN-I产生的分子机制
THP1细胞经PMA处理后，在vorinostat存在或不存在下用2'3'-cGAMP刺激，检测TBK1和IRF3磷酸化、IRF3核转位以及IRF家族表达。
RNA-seq分析
分析vorinostat对IFN-I和B细胞相关基因表达的影响
对LPS或2'3'-cGAMP刺激的THP1-Blue ISG细胞，在vorinostat存在或不存在下进行RNA-seq，分析差异表达基因和通路富集。
体外B细胞分化实验
验证vorinostat对B细胞向浆细胞分化的抑制效果
从健康供体和SLE患者中分离B细胞，在含R848、BAFF、IL-21等刺激物的培养基中培养，加入vorinostat或anifrolumab，检测浆细胞分化比例和抗体产生。
SAVI小鼠体内治疗实验
评估vorinostat对IFN-I相关炎症疾病的治疗效果
给SAVI小鼠腹腔注射vorinostat（20 mg/kg）每天一次，持续8周，检测肺部炎症、纤维化、血清IFN-I水平及肾脏损伤指标。
NZB/W F1小鼠狼疮模型治疗实验
评估vorinostat对SLE疾病进展和生存的影响
给22周龄雌性NZB/W F1小鼠腹腔注射vorinostat（20 mg/kg）每周5次，持续16周，监测存活率、蛋白尿、血清学指标；另用25周龄小鼠以40 mg/kg每日注射4周，评估肾脏病理和免疫细胞变化。
评估其他HDAC抑制剂
确定介导vorinostat效应的HDAC亚型，并比较其他临床HDAC抑制剂的效果
使用选择性HDAC1、2、3、6抑制剂和TBK1抑制剂比较对IFN-I产生和浆细胞分化的影响；并比较vorinostat与其他批准HDAC抑制剂的效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物筛选 | Prestwick化学文库 | Prestwick Chemical | -- |
| 细胞培养 | THP1-Blue ISG细胞 | InvivoGen | -- |
| 药物筛选 | 雷西莫特（R848） | -- | -- |
| 2'3'-环鸟苷酸-腺苷酸 | -- | -- | |
| 通用I型干扰素 | -- | -- | |
| IFN-I产生测定 | HEK-Blue IFN-α/β报告细胞 | InvivoGen | -- |
| B16-Blue IFN-α/β报告细胞 | InvivoGen | -- | |
| 细胞活力测定 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Laboratories | -- |
| IFN-I产生测定 | QUANTI-Blue检测试剂盒 | InvivoGen | -- |
| Western blot | 抗IRF3抗体 | -- | -- |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488标记的抗兔IgG | -- | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| Keyence BZ-X800显微镜 | Keyence | -- | |
| RNA-seq | FastGene RNA Premium试剂盒 | NIPPON Genetics | -- |
| Bioanalyzer RNA Nano芯片 | Agilent Technologies | -- | |
| TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| RT-qPCR | Tissue Lyser II组织研磨仪 | QIAGEN | -- |
| QIAzol裂解试剂 | QIAGEN | -- | |
| NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| QuantStudio 7实时荧光定量PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TaqMan基因表达检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| B细胞分化 | EasySep人B细胞富集试剂盒II | STEMCELL Technologies | -- |
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD16/32抗体 | BioLegend | 101302 |
| 人FcR阻断试剂 | Miltenyi Biotec | -- | |
| BD FACS Canto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| BD FACS Symphony A1流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 动物实验 | 伏立诺他 | -- | -- |
| LC-MS | UltiMate 3000 RSLCnano液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Exploris 240质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| InertCore Plus C18色谱柱 | GL Sciences | -- | |
| 蛋白尿测定 | 尿液试纸 | Siemens Healthcare Diagnostics | -- |
| 免疫组化 | 四甲基罗丹明标记的山羊抗小鼠IgG | -- | -- |
| FITC标记的驴抗小鼠IgM | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| 大鼠抗C3单克隆抗体 | Abcam | -- | |
| Alexa Fluor 647标记的驴抗大鼠IgG | Invitrogen | -- | |
| FV-3000共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| B细胞分化 | 阿尼鲁单抗 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 药物筛选 | 筛选浓度1 μM，刺激物R848（10 μg/mL）或2'3'-cGAMP（5 μg/mL），处理24小时。 阅读提示：Methods: Drug screening; Figure 1B,1C |
| 体外IFN-I产生 | THP1-Blue ISG细胞密度1×10^5 cells/well，vorinostat浓度1-100 μM，LPS 500 ng/mL，2'3'-cGAMP 5 μg/mL，R848 5 μg/mL，处理24小时。 阅读提示：Methods: In vitro IFN-I production assay; Figure 1D,1E |
| 机制研究 | THP1细胞PMA处理，2'3'-cGAMP刺激4小时，检测TBK1/IRF3磷酸化、IRF3核转位、IRF家族表达。 阅读提示：Methods: Western blotting and fluorescence imaging; Figure 2 |
| B细胞分化 | B细胞分离方法（EasySep），刺激物：R848 1 μg/mL、BAFF 10 ng/mL、IL-21 10 ng/mL、IL-2 50 U/mL、IFN-γ 20 ng/mL、anti-IgG 10 μg/mL，vorinostat浓度0.25-2 μM，培养3天后再培养4-7天。 阅读提示：Methods: In vitro B cell differentiation assay; Figure 4 |
| SAVI小鼠实验 | 杂合SAVI N153S小鼠，vorinostat 20 mg/kg腹腔注射每日一次，持续8周，每组7只。 阅读提示：Methods: In vivo vorinostat administration in lupus-prone mice; Figure 3 |
| NZB/W F1小鼠实验 | 22周龄雌性NZB/W F1小鼠，vorinostat 20 mg/kg每周5次，16周（每组18只）；25周龄小鼠，40 mg/kg每日一次，4周（每组9只）。 阅读提示：Methods: In vivo vorinostat administration in lupus-prone mice; Figure 5 |
| 其他HDAC抑制剂比较 | 选择性HDAC1、2、3、6抑制剂和GSK8612浓度、PBMCs刺激条件（R848 2.5 μg/mL），检测IFN-I活性、TNF-α和IL-6水平、ASC分化。 阅读提示：Figure 6; Supplementary Figure S5 |