TCGA转录组分析CD8+ T细胞浸润及临床病理特征
比较HT-PTC与非HT-PTC在临床特征和CD8+ T细胞浸润上的差异。
从TCGA数据库获取PTC患者的RNA表达数据和临床信息，根据HT状态分组，使用CIBERSORT算法估计CD8+ T细胞浸润比例，并比较临床病理特征。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
桥本甲状腺炎相关甲状腺乳头状癌中的CD8+ T细胞
CD8+ T Cells in Hashimoto's Thyroiditis-Associated Papillary Thyroid Carcinoma
实验完整度
高包含TCGA转录组分析、临床组织样本验证、原代CD8+ T细胞分离及功能实验（细胞因子分泌、共培养抑制、增殖迁移）等多个独立实验层级，并进行了机制相关验证。
主要模型
TCGA PTC患者队列 临床手术切除的PTC组织样本（HT-PTC与非HT-PTC） 原代CD8+ T细胞（来源于肿瘤组织、癌旁组织及外周血） 甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1
重点核对
HT-PTC与非HT-PTC的分组标准（病理学淋巴ocytic甲状腺炎及甲状腺自身抗体阳性） 原代CD8+ T细胞分离组织来源及纯度（>70%） 共培养实验效靶比（5:1）及时间点（6、12、24、48小时） 功能检测的刺激条件（PMA、离子霉素、BFA）及时间（6小时）
摘要
甲状腺乳头状癌（PTC）是最常见的甲状腺恶性肿瘤，常与桥本甲状腺炎（HT）共存。临床观察表明，HT-PTC往往表现出较不具侵袭性的临床病理特征；然而，这种现象背后的免疫特征尚不完全清楚。在本研究中，我们结合转录组分析和实验验证，探讨了HT-PTC中CD8+ T细胞的特征。TCGA数据分析显示，与非HT-PTC相比，HT-PTC中CD8+ T细胞浸润增加。在我中心手术切除的标本中，进一步表征了来源于HT-PTC的原代CD8+ T细胞。肿瘤来源的CD8+ T细胞保持了细胞因子分泌能力，并显示出较低的TIM-3和LAG-3表达，同时颗粒酶B水平较高。在共培养实验中，这些细胞与甲状腺癌细胞的增殖和迁移减少相关。总体而言，HT-PTC中的CD8+ T细胞未表现出明显的耗竭相关特征模式，并保留了功能活性。这种免疫特征可能与观察到的HT-PTC较不具侵袭性的行为相关，并为未来的免疫知情风险分层策略提供生物学参考。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 桥本甲状腺炎相关甲状腺乳头状癌（HT-PTC）中CD8+ T细胞的浸润、功能状态及其与临床惰性特征的关联。
- 核心机制
- HT-PTC中CD8+ T细胞未出现显著耗竭特征，低表达TIM-3和LAG-3、高表达颗粒酶B，且保留细胞因子分泌和细胞毒功能，可能通过抑制肿瘤细胞增殖和迁移参与降低肿瘤侵袭性。
- 主要证据
- TCGA数据分析显示HT-PTC中CD8+ T细胞浸润显著增加；手术标本中CD8A表达升高；原代CD8+ T细胞功能实验显示细胞因子分泌能力保留、共培养抑制TPC-1细胞增殖和迁移。
- 研究意义
- 为HT-PTC较不具侵袭性的临床特征提供了免疫学基础，并为未来免疫知情风险分层策略提供初步生物学支持。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
临床组织样本中CD8A表达和CD8+ T细胞浸润验证
在独立临床样本中验证HT-PTC中CD8+ T细胞浸润的增加。
收集71例PTC手术标本（19例HT-PTC，52例非HT-PTC），通过RT-PCR检测CD8A mRNA表达，IHC检测CD8A阳性细胞，流式细胞术检测CD3+CD8+ T细胞比例。
原代CD8+ T细胞分离与功能评估
评估HT-PTC来源的CD8+ T细胞的耗竭相关特征、细胞因子分泌和细胞毒功能。
从17例肿瘤较大的患者（6例HT-PTC，11例非HT-PTC）及对照外周血中分离原代CD8+ T细胞，通过流式检测PD-1表达和刺激后细胞因子分泌，并通过mIF分析TIM-3、LAG-3和颗粒酶B表达。
共培养实验评估CD8+ T细胞对TPC-1细胞的影响
验证HT-PTC肿瘤来源的CD8+ T细胞是否抑制甲状腺癌细胞增殖和迁移。
将扩增的CD8+ T细胞与TPC-1细胞按5:1效靶比共培养48小时，通过CCK8检测增殖抑制率，通过划痕实验和Transwell实验检测迁移能力，并检测共培养上清中细胞因子水平。
差异基因表达与通路富集分析
探索HT-PTC与非HT-PTC之间转录组差异及涉及的信号通路。
基于TCGA数据识别差异表达基因，进行GO、KEGG富集分析，构建PPI网络并鉴定枢纽基因。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875093 |
| 胎牛血清 | BI | 04-001-1B | |
| 青霉素-链霉素 | Solarbio | P1400 | |
| CD8+ T细胞培养 | 重组人白细胞介素-2 | PeproTech | 200-02-50UG |
| 组织采集 | 组织保存液 | Bio-channel | BC-CFM-03 |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Life Technologies Corporation | -- |
| RT-PCR | 逆转录试剂盒 | TaKaRa | RR036A |
| 实时PCR试剂盒 | TaKaRa | RR820A | |
| IHC | 免疫组化封闭液 | Beyotime | P0102 |
| CD8a抗体 | Servicebio | GB115692-100 | |
| mIF | CD8a抗体 | Proteintech | 66868-1-Ig |
| TIM3抗体 | Proteintech | 11872-1-AP | |
| LAG3抗体 | Proteintech | 29548-1-AP | |
| 颗粒酶B抗体 | Proteintech | 13588-1-AP | |
| iF440-酪胺 | Servicebio | G1250 | |
| iF488-酪胺 | Servicebio | G1231 | |
| iF555-酪胺 | Servicebio | G1233 | |
| iF647-酪胺 | Servicebio | G1232 | |
| mIF扫描 | Pannoramic MIDI数字切片扫描仪 | 3DHISTECH | -- |
| mIF分析 | HALO平台 | Indica Labs | -- |
| 细胞因子检测 | IL-2 ELISA试剂盒 | 4A BIOTECH | CHE0057-096 |
| IFN-γ ELISA试剂盒 | 4A BIOTECH | CHE0017-096 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | 4A BIOTECH | CHE0019-096 | |
| 组织消化 | II型胶原酶 | MKbio | 9001-12-1 |
| 脱氧核糖核酸酶 | MKbio | 9003-98-9 | |
| PBMC分离 | 淋巴细胞分离液 | Solarbio | P8610 |
| CD8+ T细胞分选 | CD8+ T细胞分选试剂盒 | Biolegend | 480011 |
| 细胞刺激 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | GLPBIO | GN10444 |
| 离子霉素 | GLPBIO | GC15148 | |
| 布雷菲德菌素A | GLPBIO | GC17683 | |
| 流式细胞术 | PD1-APC抗体 | 4A BIOTECH | -- |
| IL-2-APC抗体 | Elabscience | -- | |
| IFN-γ-APC抗体 | 4A BIOTECH | -- | |
| TNF-α-APC抗体 | 4A BIOTECH | -- | |
| T细胞活化 | CD3/CD28 T细胞激活剂 | STEMCELL | 10991 |
| 流式细胞术 | CD3-PE抗体 | Elabscience | -- |
| CD8a-FITC抗体 | Elabscience | -- | |
| 流式细胞仪（BD FACSCanto） | BD | -- | |
| CCK8实验 | CCK8试剂盒 | TargetMol | C0005 |
| 细胞培养 | TPC-1细胞系 | American Type Culture Collection | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TCGA数据分析 | HT状态判定标准（病理学淋巴细胞性甲状腺炎注释）；纳入的PTC亚型（经典型和滤泡型）；排除标准；CIBERSORT算法参数 阅读提示：Materials and Methods: Analysis of immune cell infiltration |
| 临床样本收集 | 样本来源中心；纳入和排除标准；HT定义（组织学+自身抗体）；肿瘤大小选择标准（≥1cm） 阅读提示：Materials and Methods: Clinical tissue samples |
| RT-PCR检测CD8A | 引物序列；RNA提取方法；逆转录和PCR试剂盒；内参基因（GAPDH） 阅读提示：Materials and Methods: Total RNA extraction and real-time PCR (RT-PCR) |
| IHC和mIF染色 | 一抗抗体信息（CD8a, TIM3, LAG3, Granzyme B）；稀释比例；抗原修复条件；TSA试剂及顺序；扫描仪和定量平台 阅读提示：Materials and Methods: Immunohistochemistry (IHC) staining and multiplex immunofluorescence (mIF) analysis |
| 原代CD8+ T细胞分离 | 样本来源（肿瘤组织、癌旁组织、外周血）；分离方法（负选磁珠）；纯度评估标准（>70%）；细胞活力（92.6%±2.1%） 阅读提示：Materials and Methods: Isolation of primary CD8+ T cells |
| CD8+ T细胞功能检测 | 刺激物及浓度（PMA 50 ng/mL, Ionomycin 1 μg/mL, BFA 10 μg/mL）；刺激时间（6小时）；检测的细胞因子（IL-2, IFN-γ, TNF-α）和表面分子（PD-1） 阅读提示：Materials and Methods: Functional assay of primary CD8+ T cells |
| CD8+ T细胞活化 | 活化剂及浓度（CD3/CD28 activator 25 μL/mL）；培养时间（3天）；细胞密度（1×10^6 cells/mL） 阅读提示：Materials and Methods: Activation of primary CD8+ T cells |
| 共培养实验 | 效靶比（5:1）；共培养时间（48小时）；CD8+ T细胞扩增时间（14天）；TPC-1培养时间（14天）；重复孔设置（双复孔） 阅读提示：Materials and Methods: Coculture of TPC-1 and CD8+ T cells |
| 增殖和迁移检测 | CCK8检测时间点（1-7天）；划痕实验初始创口（200 μL枪头）；观察时间（24、48、72小时）；Transwell迁移时间（24小时）；细胞密度 阅读提示：Materials and Methods: CCK8 proliferation assay, Wound healing assay, Transwell migration assay |