患者样本单细胞多组学分析
表征Ven/Gilt治疗前后AML的克隆进化、免疫表型和转录变化
对12例R/R FLT3突变AML患者的35份纵向样本进行单细胞DNA测序，其中18份进行DAbseq，4例患者进行CITEseq。
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动态的遗传性和非遗传性RAS通路激活驱动对FLT3和BCL2抑制剂治疗的耐药
Dynamic genetic and nongenetic RAS pathway activation drives resistance to FLT3 and BCL2 inhibitor therapy
实验完整度
高包含患者样本的单细胞DNA/蛋白质和RNA/蛋白质分析、体外耐药细胞系生成与功能验证、MEK/RAS抑制回敏实验及激酶组分析，涉及多证据层级。
主要模型
R/R FLT3突变AML患者队列（NCT03625505试验） MOLM-14细胞系（FLT3-ITD/NRAS G12C共突变） Ven/Gilt-R、Ven-R耐药细胞系 NRAS野生型MOLM-14细胞系
重点核对
Ven/Gilt耐药与RAS突变克隆的选择相关（4例患者出现9个RAS突变克隆扩增） 非突变性RAS转录激活及单核细胞分化与耐药相关（RAS突变状态不影响） MEK抑制剂曲美替尼或RAS抑制剂daraxonrasib可恢复耐药细胞对维奈克拉/吉特替尼的敏感性 耐药的Ven/Gilt-R细胞中检测到RAF1 S257L和BAX R94*突变（VAF分别为48%和16%）
摘要
对复发肿瘤的批量测序揭示了与癌症治疗耐药相关的突变，但不足以全面评估复发的所有原因。由于固有的肿瘤异质性，治疗中的肿瘤进化可能选择基因上不同的克隆或恶性转录状态的转变，这些无法通过批量测序解决。我们对在BCL2抑制剂维奈克拉和FLT3抑制剂吉特替尼（Ven/Gilt）的1b期临床试验中接受治疗的急性髓系白血病（AML）患者队列进行了多组学单细胞（SC）DNA/蛋白质和RNA/蛋白质分析，以表征驱动耐药的免疫表型、转录和遗传克隆进化。我们发现，虽然Ven/Gilt有效消除了FLT3突变克隆，但耐药与通过多种机制的RAS激活相关，包括选择RAS突变克隆、非突变性上调RAS转录程序以及向RAS相关的单核细胞AML分化转变。在与非突变性RAS转录激活相关的单核细胞分化的体外模型中，我们证明了RAS通路抑制可重新使细胞对Ven/Gilt敏感。这些数据表明，患者中趋同的耐药通路可通过多种遗传和非遗传机制激活。这些结果强调，RAS信号传导是FLT3和BCL2抑制剂耐药的核心，与AML单核细胞分化紧密耦合，并强调RAS通路抑制作为对抗耐药的可行临床策略。CT# NCT03625505
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Ven/Gilt治疗R/R FLT3突变AML的耐药机制是什么？特别是RAS通路激活和单核细胞分化在耐药中的作用。
- 核心机制
- Ven/Gilt耐药与RAS信号激活相关，可通过RAS突变或非突变性转录上调发生，并与AML单核细胞分化紧密耦合。
- 主要证据
- 单细胞DNA/蛋白质分析显示FLT3突变克隆减少，RAS突变克隆扩增；单细胞RNA/蛋白质分析显示单核细胞免疫表型和转录特征增加；体外耐药细胞系中RAS信号和单核细胞分化上调；MEK/RAS抑制恢复敏感性。
- 研究意义
- 研究表明RAS通路抑制是克服Ven/Gilt耐药的可行临床策略，提示联合FLT3、BCL2和RAS通路抑制的治疗潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外耐药细胞系建立
模拟Ven/Gilt和维奈克拉的耐药，研究其机制
将NRAS G12C和FLT3-ITD共突变MOLM-14细胞在递增剂量的维奈克拉（有或无吉特替尼）中培养，生成Ven/Gilt-R和Ven-R细胞系，并进行bulk RNA-seq、全外显子测序和激酶组分析。
MEK和RAS抑制回敏实验
验证抑制RAS信号是否可恢复耐药细胞对Ven/Gilt的敏感性
用曲美替尼（MEK1/2抑制剂）或daraxonrasib（多选择性RAS(ON)抑制剂）处理耐药细胞，检测递增剂量维奈克拉/吉特替尼下的增殖和凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞DNA测序 | Tapestri平台 | MissionBio | -- |
| 单细胞RNA测序 | 10x Genomics平台 | 10x Genomics | -- |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 细胞凋亡检测 | CellEvent Caspase-3/7绿色流式细胞术试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 药物处理 | 曲美替尼 | -- | -- |
| daraxonrasib | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本来源和治疗方案 | 患者队列（NCT03625505）、样本采集时间点（治疗前、治疗中、复发）、治疗药物维奈克拉和吉特替尼剂量方案 阅读提示：Methods: Patient samples; 参考文献8 |
| 单细胞DNA/蛋白质分析 | Tapestri平台、custom hotspot panel（66个基因）、9抗体panel、细胞数（中位8960/患者） 阅读提示：Methods: Single-Cell DAbseq and CITEseq; 图1A |
| 单细胞RNA/蛋白质分析 | 10x平台、CellRanger v7.0.1、Seurat v5.0.0、细胞数（中位5357/样本） 阅读提示：Methods: Single-Cell DAbseq and CITEseq; 图5A |
| 体外耐药细胞系生成 | MOLM-14细胞（NRAS G12C和FLT3-ITD共突变）、维奈克拉和吉特替尼的递增剂量方案、培养时间 阅读提示：Methods: Cell Line Generation and Analysis |
| MEK和RAS抑制回敏实验 | 曲美替尼或daraxonrasib的浓度、维奈克拉/吉特替尼剂量范围、48小时处理时间、增殖和凋亡检测方法 阅读提示：Results: MEK and RAS inhibition resensitizes resistant cells; 图7C-F |