建立SNS-CKO和WT小鼠模型并感染PA
评估感觉神经元中miR-183C缺失对PA角膜炎的影响。
使用SNS-CKO小鼠（Nav1.8-Cre; miR-183Cf/f; R26LSL-RFP; Csf1r-EGFP）和WT同窝小鼠，左眼角膜划痕后接种5.0×10^6 CFU的PA菌株19660。
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铜绿假单胞菌角膜炎中神经免疫相互作用的新见解
New insight into the neuroimmune interplay in Pseudomonas aeruginosa keratitis
实验完整度
高包含SN特异性条件敲除小鼠模型、角膜平铺片共聚焦成像、MPO测定和菌落计数等多种实验方法，进行了功能验证和机制探讨。
主要模型
感觉神经元特异性miR-183C条件敲除小鼠（SNS-CKO）及其野生型同窝小鼠 PA感染的角膜组织（体内模型）
重点核对
小鼠基因型（SNS-CKO: Nav1.8-Cre(+/−);miR-183Cf/f;R26LSL-RFP(+/+);Csf1r-EGFP(+/+)） PA感染剂量：5.0 × 10^6 CFU/角膜（ATCC 19660） 感染后时间点：3、6、12 hpi及1、3、5 dpi CSN密度和MC数量/荧光体积的定量方法
摘要
目的：本研究旨在揭示miR-183/96/182簇（miR-183C）在感觉神经元（SN）中于铜绿假单胞菌（PA）角膜炎期间角膜感觉神经（CSN）与髓系细胞（MC）相互作用中的作用。方法：将SN特异性（SNS）条件性敲除（CKO）小鼠及其野生型（WT）同窝小鼠的左眼角膜感染PA。这些小鼠的CSN表达RFP；MC表达EGFP。进行了角膜平铺片的共聚焦显微镜检查、髓过氧化物酶（MPO）测定和菌落计数。结果：在WT小鼠中，CSN在感染后3小时（hpi）开始退化，从中央区域的上皮/上皮下层开始。到感染后1天（dpi），上皮/上皮下CSN几乎完全破坏，而基质神经仍存在。从3 dpi起，CSN在两层均被消灭。在CKO与WT小鼠中，CSN密度在3和6 hpi时降低；然而，CSN退化速度较慢。在3 dpi时，残留的大直径基质CSN保存较好。MC在3和6 hpi时在角膜中央减少，但在周边增加，在CKO小鼠中更为明显。在12 hpi时，密集堆积的MC形成环形带，环绕着一个几乎无MC的“暗区”，与CSN退化最严重的中央区域共定位。在1 dpi时，角膜充满MC；CKO小鼠的MC密度较低。CKO小鼠在1 dpi时中性粒细胞减少，在3 dpi时疾病严重程度降低。结论：我们的结果为PA角膜炎期间的神经免疫相互作用提供了新见解。CSN中的miR-183C通过调节神经免疫相互作用来调节PA角膜炎。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在铜绿假单胞菌角膜炎期间，感觉神经元中的miR-183C如何通过神经免疫相互作用影响角膜感觉神经和髓系细胞的动态变化及疾病严重程度？
- 核心机制
- miR-183C通过调节CSN密度、趋化性神经肽（如Cx3cl1）的产生以及PA诱导的TG感觉神经元激活和神经肽分泌，进而调控角膜固有免疫和髓系细胞浸润。
- 主要证据
- SNS-CKO小鼠与WT对照相比，CSN退化速度减慢，早期髓系细胞浸润加速，后期浸润减少和疾病严重程度降低（3 dpi），且MPO活性降低和细菌负荷略有增加。
- 研究意义
- 研究提供了神经免疫相互作用在PA角膜炎发病机制中的新见解，并提示miR-183C是潜在的治疗靶点，但需要同时调控感觉神经和固有免疫细胞。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
角膜平铺片共聚焦成像分析CSN和MC动态
同时观察CSN和髓系细胞在PA感染过程中的空间和时间变化。
制备角膜平铺片，使用TCS SP8共聚焦显微镜采集全角膜Z-stack图像，定量CSN密度和MC数量/荧光体积。
MPO测定和菌落计数
量化角膜中性粒细胞浸润和残留活菌数量。
在1 dpi时，通过MPO测定评估中性粒细胞数量；通过平板计数法测定角膜匀浆中的CFU。
临床严重程度评分
评估PA角膜炎的疾病严重程度。
在1、3、5 dpi，使用裂隙灯观察并按照既定标准对疾病进行分级（0-4级）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫细胞变化
检测神经和髓系细胞形态
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠模型构建 | miR-183C条件敲除等位基因（miR-183Cf/f） | European Mouse Mutant Archive | EM12387 |
| Nav1.8-Cre小鼠 | The Jackson Laboratory | Stock Number: 036564 | |
| Csf1r-EGFP（MacGreen）小鼠 | The Jackson Laboratory | Stock number: 018549 | |
| R26LSL-RFP（Ai14）小鼠 | The Jackson Laboratory | Stock number: 007914 | |
| 感染 | 铜绿假单胞菌19660菌株 | ATCC | -- |
| 角膜平铺片 | 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | -- |
| Superfrost Plus载玻片 | Fisherbrand | -- | |
| 成像 | TCS SP8激光共聚焦显微镜 | Leica Microsystems Inc. | -- |
| 图像分析 | Adobe Photoshop CS6 | Adobe | -- |
| ImageJ 1.52p | NIH | -- | |
| MPO测定 | 十六烷基三甲基溴化铵 | Sigma-Aldrich | -- |
| Helios-α分光光度计 | ThermoFisher | -- | |
| 菌落计数 | 假单胞菌分离琼脂 | Becton Dickinson | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 基因型：SNS-CKO (Nav1.8-Cre(+/−);miR-183Cf/f;R26LSL-RFP(+/+);Csf1r-EGFP(+/+))和WT同窝小鼠；年龄和性别匹配 阅读提示：Methods: Mice |
| PA感染 | 菌株ATCC 19660；剂量5.0×10^6 CFU/角膜；感染方式：角膜划痕后局部滴加5μl；时间点：3、6、12 hpi及1、3、5 dpi 阅读提示：Methods: PA infection |
| 角膜平铺片 | 固定条件：1% PFA；封片剂：Vectashield with DAPI；成像参数：10x物镜，全角膜拼接，相同激光功率和增益 阅读提示：Methods: Corneal flatmount preparation, Quantification |
| CSN和MC定量 | CSN密度：中央和周边区域各测量500×500 μm2；MC计数：3和6 hpi计数总细胞，12 hpi后测量荧光体积 阅读提示：Methods: Quantification of corneal nerve density and myeloid cells |
| MPO和菌落计数 | MPO：角膜匀浆，底物o-dianisidine，460nm吸光度；菌落计数：连续稀释涂板，37℃过夜培养 阅读提示：Methods: Myeloperoxidase (MPO) assay, Quantitation of viable bacteria |