T. mu定植与AILI模型建立
验证T. mu定植是否影响宿主对APAP诱导肝损伤的敏感性。
将纯化的T. mu过继转移到C57BL/6小鼠,并用APAP诱导肝损伤,比较定植与未定植小鼠的肝损伤程度。
包含体内动物模型、细胞实验、代谢组学与代谢流分析等多个独立证据层级,且进行了功能与机制验证
C57BL/6小鼠 T. mu定植小鼠模型 AML12小鼠肝细胞系
APAP剂量:500或700 mg/kg腹腔注射 T. mu定植与清除:采用甲硝唑清除及过继转移 SPHK/S1PR抑制:PF543、K145或FTY720处理 代谢流分析:U-13C-葡萄糖或U-13C-棕榈酸培养 检测终点:血清ALT/AST、肝组织HE染色、凋亡信号通路蛋白
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证T. mu定植是否影响宿主对APAP诱导肝损伤的敏感性。
将纯化的T. mu过继转移到C57BL/6小鼠,并用APAP诱导肝损伤,比较定植与未定植小鼠的肝损伤程度。
排除肠道细菌变化对T. mu加剧AILI作用的贡献。
使用抗生素鸡尾酒(萘啶酸、万古霉素、粘菌素)清除革兰氏阳性和阴性细菌,或用甲硝唑清除T. mu,再给予APAP,评估肝损伤指标。
鉴定T. mu定植后肠道代谢物变化,寻找可能介导肝损伤加剧的效应分子。
对盲肠内容物进行非靶向代谢组学分析,发现游离鞘氨醇和胆碱升高;在AML12细胞中验证鞘氨醇和TMAO对APAP诱导肝细胞死亡的影响。
验证T. mu加剧AILI是否依赖于鞘氨醇-SPHK1/2-S1P-S1PR轴。
在T. mu定植小鼠中,在APAP攻击前给予SPHK1抑制剂PF543、SPHK2抑制剂K145或S1PR拮抗剂FTY720,检测肝损伤指标和存活率。
阐明T. mu合成鞘氨醇的代谢途径。
在优化培养基中培养T. mu,分别添加U-13C-棕榈酸或U-13C-葡萄糖,进行13C标记的代谢流示踪分析,检测标记的鞘氨醇及中间代谢物。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 对乙酰氨基酚 | MCE | HY-66005 |
| 盐酸芬戈莫德 | MCE | HY-12005 | |
| PF-543柠檬酸盐 | MCE | HY-15425 | |
| K145盐酸盐 | MCE | HY-15779A | |
| 萘啶酸 | Sangon Biotech | A610363 | |
| 万古霉素 | Sangon Biotech | A600983 | |
| 硫酸粘菌素 | Macklin | C805491 | |
| 甲硝唑 | Sangon Biotech | A600633 | |
| 3,3-二甲基-1-丁醇 | Merck | 183105 | |
| 染色 | 瑞氏-吉姆萨染色试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D010 |
| 血清生化 | ALT检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A009 |
| AST检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A010 | |
| 代谢流分析 | U-13C标记葡萄糖 | Shanghai Yuanye Bio-Technology | S25147 |
| U-13C标记棕榈酸 | Shanghai Yuanye Bio-Technology | T80363 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000-044 | |
| 细胞处理 | 鞘氨醇 | MCE | HY-101047 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Biosharp | BS350B |
| 细胞毒性检测 | 乳酸脱氢酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A020-2-2 |
| 流式分析 | Zombie Aqua™可固定活力检测试剂盒 | Biolegend | 423101 |
| Western blot | 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell signaling technology | 4967 |
| 抗PERK抗体 | Cell signaling technology | 3192 | |
| 抗磷酸化PERK抗体 | Cell signaling technology | 3179 | |
| 抗JNK抗体 | Cell signaling technology | 9252 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Cell signaling technology | 4668 | |
| 抗ASK1抗体 | Cell signaling technology | 3762 | |
| 抗磷酸化ASK1抗体 | Cell signaling technology | 3765 | |
| 抗CHOP抗体 | Wanleibio | WL00880 | |
| 16S rDNA测序 | NEXTFLEX Rapid DNA-Seq试剂盒 | Bioo Scientific | -- |
| 代谢组学 | Agilent 1290 Infinity液相色谱系统 | Agilent Technologies | -- |
| Triple TOF 5600质谱仪 | AB SCIEX | -- | |
| 代谢流分析 | Thermo Vanquish超高效液相色谱系统 | Thermo | -- |
| 鞘氨醇和S1P定量 | AB Sciex ExionLC液相色谱系统 | AB Sciex | -- |
| Triple Quad 3500质谱仪 | AB Sciex | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 雄性C57BL/6小鼠(6-8周龄) 阅读提示:见Materials and methods中Animal studies部分 |
| APAP诱导肝损伤 | APAP剂量:500 mg/kg或700 mg/kg,腹腔注射 阅读提示:见Materials and methods中Animal studies部分 |
| T. mu定植与清除 | T. mu过继转移方法;甲硝唑3 g/L饮水清除 阅读提示:见Materials and methods中T. mu quantification部分及Figure 1 legend |
| 信号通路干预 | FTY720 10 mg/kg/d腹腔注射、PF543 10 mg/kg腹腔注射、K145 50 mg/kg口服 阅读提示:见Materials and methods中Animal studies部分及Figure 3 legend |
| 细胞实验 | AML12细胞培养条件;APAP浓度5 mM;鞘氨醇浓度0-5 μg/mL;TMAO浓度0-1000 μM 阅读提示:见Materials and methods中Cell culture部分及Figure 2 legend |
| 代谢流分析 | 优化培养基;U-13C-葡萄糖5 g/L或U-13C-棕榈酸200 μM;培养48 h 阅读提示:见Materials and methods中13C-labeled metabolic flux tracing分析部分 |