样本收集与处理
获取骨骼肌活检样本用于空间转录组分析。
收集8例DYS患者和4例健康对照的骨骼肌活检样本，新鲜冷冻后包埋。
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揭示肌营养不良症的空间图景：贝克尔与杜氏肌营养不良的转录组学研究
Unraveling the spatial landscape of dystrophinopathies: a transcriptomic approach to Becker and Duchenne muscular dystrophies
实验完整度
中研究包括空间转录组学、免疫荧光、差异表达、去卷积、细胞通讯分析等，但缺乏功能验证实验。
主要模型
患者骨骼肌活检样本（8例DYS，4例HC） 健康对照骨骼肌活检样本
重点核对
活检样本来源：美国与荷兰，不同肌肉部位 Visium空间转录组学：10x Genomics Visium，切片厚度10μm 去卷积参考数据：Suárez-Calvet等单核RNA测序数据 模块注释：基于标记基因表达 差异表达分析：伪bulk方法，筛选|log2FC|>0.5，校正p<0.05
摘要
肌营养不良症由DMD基因的致病性变异引起，导致肌营养不良蛋白部分（贝克尔）或完全（杜氏）缺失。贝克尔（BMD）和杜氏肌营养不良（DMD）以进行性肌肉萎缩、脂肪替代、纤维化和功能丧失为特征。为研究组织病理学变化，我们使用Visium空间转录组学对肌营养不良症患者（n=8）和健康对照（n=4）的骨骼肌活检样本进行分析。我们应用去卷积策略，利用先前发表的单核RNA测序数据估计各样本中细胞类型的比例及其空间定位。我们鉴定了脂肪斑块中富集的基因，以及活跃病理区域中的细胞类型，如纤维脂肪祖细胞（FAPs）。利用配体-受体对的表达数据，我们突出了导致纤维化和脂肪生成病变的细胞间通讯。最后，对相邻肌肉和脂肪区域的基因表达梯度分析，使我们能够识别与肌肉区域即将转变为脂肪相关的基因。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肌营养不良症中肌肉组织被纤维脂肪组织替代的机制，包括驱动基因和细胞类型。
- 核心机制
- FAPs是病变的主要驱动因素，通过表达LPL等配体与周围细胞（如表达LRP1的FAPs）通讯，促进脂肪生成和纤维化。
- 主要证据
- 空间转录组学显示DYS样本中IIx型纤维显著减少、结缔组织增加；去卷积显示FAPs在纤维化区域和脂肪周围富集；细胞通讯分析鉴定了LPL^LRP1等配体-受体对；SPATA2分析发现FABP4等基因呈梯度表达。
- 研究意义
- 本研究提供了人类骨骼肌的空间转录组图谱，鉴定出新的标志基因（如LPL、LRP1）和细胞类型，可能用于监测肌营养不良蛋白恢复治疗的效果。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Visium空间转录组实验
获取保留空间信息的全转录组表达数据。
对冷冻切片进行H&E染色和成像，然后进行透化、反转录、文库构建，并在Illumina NovaSeq6000上测序。
组织注释
基于组织学和基因表达将Visium斑点分类为脂肪、结缔组织和肌纤维类型。
手动绘制脂肪掩膜，基于模块评分（如COL1A1、COL1A2、THBS4等结缔组织标记）和肌球蛋白基因表达（MYH7、MYH2、MYH1）进行注释。
差异基因表达分析
比较健康对照和肌营养不良症样本间各组织模块的转录组差异。
使用muscat包进行伪bulk差异表达分析，比较HC与DYS在每个模块中的基因表达。
去卷积分析
估计每个Visium斑点中的细胞类型组成。
使用CARD包，基于snRNAseq参考数据（Suárez-Calvet等）对Visium数据进行去卷积。
细胞通讯分析
研究脂肪沉积周围各层细胞间的配体-受体相互作用。
使用LIANA+计算脂肪周围层（L0-L1、L1-L2、L2-L3）的细胞通讯分数，并使用Tensor-Cell2Cell进行趋势分析。
空间脂肪分析
鉴定与脂肪组织距离相关的基因表达梯度。
使用SPATA2鉴定脂肪区域周围的基因表达模式，筛选与距离相关的基因。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 空间转录组实验 | Visium空间基因表达载玻片 | 10x Genomics | PN: |
| CryoStar NX70冷冻切片机 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 成像 | 蔡司Axio Scan.Z1玻片扫描仪 | Carl Zeiss LTD | -- |
| 尼康Eclipse Ti2-E倒置显微镜 | Nikon Instruments | -- | |
| 空间转录组实验 | Illumina NovaSeq6000测序仪 | Illumina, Inc. | -- |
| 免疫荧光 | 抗FN1抗体 | Santa Cruz | sc-8422 |
| Alexa Fluor 647偶联二抗 | Life Technologies | A21235 | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂（含DAPI） | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Superfrost Plus粘附载玻片 | Thermo Fisher Scientific | J1820AMNZ | |
| ImmEdge疏水笔 | Vector Labs | H-4000 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 样本量：8例DYS，4例HC；年龄范围：DYS 3-12岁，HC 14-28岁；肌肉部位：DYS大多为股四头肌，HC为腘绳肌或腓肠肌；来源：美国（Nationwide Children's Hospital）和荷兰（LUMC） 阅读提示：Table 1, Materials and methods (Ethical approval and patient consent, Skeletal muscle biopsies) |
| Visium空间转录组 | 切片厚度10μm，Visium载玻片（PN 2000233），透化15分钟，测序目标125M reads/样本；具体Cq循环数见补充表S7 阅读提示：Materials and methods (Spatial Visium experiments) |
| 组织注释 | 模块标记基因列表（补充表S1）；阈值选择基于normalmixEM迭代500次多数投票 阅读提示：Materials and methods (Visium spot annotation using module scoring) |
| 去卷积分析 | 参考snRNAseq数据来自Suárez-Calvet等（含HC和DMD样本）；排除B/T细胞；每种细胞类型选择前50个标记基因（调整p<0.05） 阅读提示：Materials and methods (Deconvolution) |
| 细胞通讯分析 | 层定义L0-L3；配体-受体表达阈值：至少60%斑点表达，且平均表达至少两倍高于非层斑点；使用LIANA Consensus数据库 阅读提示：Materials and methods (Cell-cell communication analysis), Figure 5 |
| 空间脂肪分析 | 样本选择：5个有显著脂肪浸润的DYS样本；筛选标准：调整p<0.05，RMSE<0.25；使用SPATA2 阅读提示：Materials and methods (Spatial fat analysis), Figure 6 |