用于湄公河流域环境DNA检测湄公河血吸虫及其中间宿主螺类Neotricula aperta的多重qPCR方法的开发与实地评估

背景：湄公血吸虫（Schistosoma mekongi）仍是湄公河下游流域肠道血吸虫病的重要致病源。需要灵敏的环境监测工具来支持传播监测，特别是在传统螺类调查受季节限制的地区。本研究开发并评估了一种多重定量PCR（qPCR）检测方法，用于同时检测水生环境DNA（eDNA）样本中的湄公血吸虫及其中间螺类宿主——小泡螺（Neotricula aperta）。方法：通过比较针对湄公血吸虫和小泡螺的单重及多重qPCR检测，确定最佳扩增体系。现场验证于2024年旱季（5月）和雨季（8月）在老挝占巴塞省孔县20个传播点进行。使用Cohen's kappa系数评估eDNA检测与软体动物学调查的方法一致性，并采用Spearman秩相关分析小泡螺密度与理化变量之间的关联。结果：针对小泡螺（16S rRNA）和湄公血吸虫（18S rRNA）优化的多重qPCR检测显示高灵敏度，检测限分别为5拷贝/μl和6拷贝/μl，定量限分别为40拷贝/μl和46拷贝/μl。在中宇宙实验中，两个靶标在感染螺密度为1螺/升时均被检出，小泡螺和湄公血吸虫的中位Cq值分别为35.23和26.54。旱季调查共采集978只小泡螺，平均密度为每站点46.25只；雨季调查未能实施。压碎镜检未发现血吸虫感染。现场eDNA分析检测到小泡螺但未检出湄公血吸虫，小泡螺eDNA阳性率在旱季为90%，雨季为40%。与软体动物学调查的一致性中等（κ=0.44；p=0.01），螺密度与水温、pH值和溶解氧显著相关。结论：该多重eDNA检测方法能灵敏地检测现场水样中的小泡螺，有助于克服软体动物学调查的季节性限制。虽然在实验室条件下能检测到湄公血吸虫，但在现场样本中未检出，这与未发现感染螺的结果一致。需在活跃传播点进一步验证，才能确保湄公血吸虫eDNA现场检测的可靠性。