模型建立与放疗处理
建立HNSCC异种移植瘤模型，并通过局部放疗诱导炎症反应，以模拟临床放疗场景。
皮下接种FaDu或Cal33细胞于裸鼠后肢，当肿瘤直径达5-6 mm时，分为非照射（Ctrl）和照射（RT）组。对肿瘤局部照射5 Gy两次（总10 Gy）。同时培养FaDu细胞，照射2 Gy五次（总10 Gy）。
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评估[18F]F-DPA作为头颈癌中TSPO靶点，在正常条件和放疗后的作用
Evaluation of [18F]F-DPA as a target for TSPO in head and neck cancer under normal conditions and after radiotherapy
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内异种移植瘤模型、离体生物分布、放射自显影、放射性代谢物分析及免疫组化等多层次验证，并通过TSPO siRNA和PK11195阻断实验进行功能性验证。
主要模型
FaDu细胞系 Cal33细胞系 FaDu肿瘤异种移植模型 Cal33肿瘤异种移植模型
重点核对
FaDu和Cal33细胞系；异种移植模型使用雌性裸鼠（Hsd:athymic Nude-Foxn1nu） 放疗方案：肿瘤局部照射5 Gy×2天（总10 Gy），细胞照射2 Gy×5天（总10 Gy） 示踪剂[18F]F-DPA注射剂量（MBq）和质量（ng） PK11195预处理剂量（1 mg，腹膜内注射，注射前30分钟） TSPO siRNA沉默效率（蛋白降低80%，mRNA降低54%）
摘要
背景：许多恶性肿瘤中TSPO表达增加，这与不良预后相关。TSPO-PET示踪剂在周围性肿瘤中尚未得到全面评估。本研究旨在评估N,N-二乙基-2-(2-(4-([18F]氟)苯基)-5,7-二甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)乙酰胺([18F]F-DPA)是否能反映放疗(RT)诱导的头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中TSPO活性的变化。方法：使用RT诱导HNSCC异种移植瘤和细胞中的炎症反应。在体内测量非照射和照射肿瘤中[18F]F-DPA的摄取，随后进行离体生物分布、放射自显影和放射性代谢物分析。在亲本和TSPO沉默(TSPO siRNA)细胞中进行体外研究。同时评估TSPO蛋白和mRNA表达，以及肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)。结果：体内成像和离体测量显示，与未照射肿瘤相比，照射肿瘤中[18F]F-DPA摄取显著升高。体外细胞标记研究证实了这一发现，而在TSPO siRNA细胞中未检测到RT对[18F]F-DPA摄取的影响。放射性代谢物分析显示，肿瘤中未改变的[18F]F-DPA含量为95%，照射后也是如此。PK11195预处理使异种移植瘤中[18F]F-DPA的肿瘤-血液比降低73%，在细胞中降低88%。RT后TSPO蛋白和mRNA水平升高，但变异性很大。RT后M1/M2 TAMs的比例下降，而单核细胞和迁移性单核细胞/巨噬细胞的比例增加。结论：[18F]F-DPA可以检测HNSCC中RT后TSPO表达水平的变化，这似乎并不反映炎症。但是，仍需要进一步的研究来阐明RT后TSPO调控的生理机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估[18F]F-DPA作为TSPO PET示踪剂，在放疗诱导的炎症条件下，能否反映头颈鳞状细胞癌（HNSCC）中TSPO活性的变化。
- 核心机制
- 放疗后HNSCC细胞和肿瘤中[18F]F-DPA摄取增加，且该摄取依赖于TSPO表达，但不依赖于炎症巨噬细胞；RT可能通过影响细胞代谢或ROS稳态（推测）导致TSPO表达变化。
- 主要证据
- 体内成像和离体测量显示照射肿瘤摄取显著升高；体外细胞实验证实RT诱导摄取增加，TSPO siRNA细胞无此效应；PK11195阻断使T/B比降低73%（肿瘤）和88%（细胞）。
- 研究意义
- 研究表明[18F]F-DPA可用于癌症TSPO成像，可能有助于评估预后和治疗反应；但需进一步研究RT后TSPO调控的生理机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内PET/CT成像
评估放疗后[18F]F-DPA在肿瘤中的摄取变化，并与[18F]FDG摄取比较。
分别在放疗后1周或2周，对FaDu和Cal33荷瘤小鼠进行PET/CT成像。注射[18F]F-DPA后20-40分钟采集静态图像，[18F]FDG在注射后60-80分钟采集。分析肿瘤摄取（% ID/mL）。
离体生物分布与放射自显影
定量评估[18F]F-DPA在不同组织中的分布，并可视化肿瘤内的放射性分布。
注射[18F]F-DPA后40分钟，处死小鼠，采集血液和组织，测量放射性并计算% ID/g。肿瘤切片进行放射自显影。
放射性代谢物分析
评估[18F]F-DPA在肿瘤和血浆中的代谢稳定性，以确认摄取是否代表完整的示踪剂。
注射后40分钟，取血浆和肿瘤样本，沉淀蛋白后通过薄层色谱（TLC）分析放射性代谢物，计算未变化示踪剂比例。
体外细胞摄取实验
在体外验证RT对[18F]F-DPA摄取的影响，并评估TSPO特异性和PK11195阻断效果。
对亲本FaDu、NT siRNA和TSPO siRNA细胞进行体外摄取实验。细胞暴露于[18F]F-DPA（0.5 MBq/mL）60分钟，部分实验用PK11195（10 μM）预处理。测量放射性计数并归一化至活细胞数。
分子表达分析
评估放疗后TSPO蛋白和mRNA表达变化，以及放疗诱导的DNA损伤。
通过Western blot检测TSPO和γH2Ax蛋白表达，通过RT-qPCR检测TSPO mRNA水平。
肿瘤微环境分析
评估放疗对肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）亚群的影响，以探讨巨噬细胞在[18F]F-DPA摄取中的作用。
从肿瘤中制备单细胞悬液，通过流式细胞术分析单核细胞、未成熟/迁移性巨噬细胞、M1和M2巨噬细胞的比例。
免疫组化分析
评估放疗后肿瘤中TSPO、cleaved caspase-3和phospho-histone H3的表达，以关联细胞增殖和凋亡。
对肿瘤切片进行免疫组化染色，使用QuPath软件定量阳性细胞百分比。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| MEM非必需氨基酸 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| HEPES缓冲液 | -- | -- | |
| TSPO沉默 | Accell siRNA | Dharmacon Horizon Discovery | -- |
| TSPO siRNA | -- | -- | |
| 非靶向siRNA | -- | -- | |
| 放疗 | Faxitron MultiRad 350照射仪 | Faxitron | -- |
| PET成像 | Inveon小动物PET/CT | Siemens | -- |
| x-和β-cube小动物PET/CT | Molecubes | -- | |
| TSPO阻断 | PK11195 | Sigma | -- |
| 放射性代谢物分析 | 薄层色谱板 | Merck Millipore | 1.05567 |
| 离体测定 | γ计数器（2480 WIZARD2） | PerkinElmer | -- |
| 放射自显影 | Fuji Analyzer BAS5000成像扫描仪 | Fuji | -- |
| 低温恒温切片机（Microm HM 500 OM） | Microm | -- | |
| 细胞摄取实验 | Cellometer auto 2000细胞计数仪 | Nexcelom | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| Mini-PROTEAN TGX预制蛋白凝胶 | Bio-Rad | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | -- | -- | |
| IRDye 800CW荧光二抗 | LI-COR Biosciences | 926-32213 | |
| IRDye 680 RD荧光二抗 | LI-COR Biosciences | 926-68072 | |
| LI-COR Odyssey CLx成像系统 | LI-COR | -- | |
| TSPO抗体 | Abcam | ab109497 | |
| γH2A.x抗体 | Abcam | ab22551 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | |
| qPCR | RNeasy Plus Mini RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| Oligo d(T) 18 mRNA引物 | New England BioLabs | -- | |
| dNTP混合物 | -- | -- | |
| RiboLock RNA酶抑制剂 | Thermo Scientific | -- | |
| 反转录缓冲液 | -- | -- | |
| Maxima反转录酶 | Thermo Scientific | -- | |
| SsoAdvanced通用SYBR Green Supermix | Bio-Rad | -- | |
| hTSPO引物 | Bio-Rad | -- | |
| hTBP引物 | -- | -- | |
| hRPLP0引物 | -- | -- | |
| 免疫组化 | TSPO抗体 | Abcam | ab109497 |
| Cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| Phospho-histone H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9701 | |
| 肿瘤微环境分析 | 胶原酶D | Roche | -- |
| DNA酶1 | Roche | -- | |
| 可固定活力染料eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| CD11b FITC抗体 | BioLegend | 101206 | |
| Ly6G PerCP-Cy5.5抗体 | BD | 560602 | |
| F4/80 APC抗体 | eBiosience | 17-4801-82 | |
| MHCII PE抗体 | BD | 557000 | |
| Ly6C-BV421抗体 | BD | 562727 | |
| 流速细胞术 | LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 数据分析 | QuPath | -- | -- |
| 统计分析 | SAS系统 | SAS Institute | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：FaDu和Cal33；培养基：DMEM补充10% FBS、L-谷氨酰胺、MEM NEAA、青霉素-链霉素；Cal33培养基额外含HEPES和丙酮酸钠 阅读提示：参见Materials and methods中的Cell culture部分 |
| TSPO沉默 | siRNA类型：Accell siRNA；浓度：1 μM；处理时间：72小时；细胞接种量：1×10^4/96孔板 阅读提示：参见Materials and methods中的TSPO silencing in cells部分 |
| 放疗 | 肿瘤照射：5 Gy/次，共2次，间隔1天；细胞照射：2 Gy/次，共5次，间隔1天；X射线条件：320 kV，10 mA，SnCuAl过滤器（肿瘤）或Al 0.5 mm（细胞），源皮距45.0 cm（肿瘤）或37.0 cm（细胞），剂量率1 Gy/min（肿瘤）或6 Gy/min（细胞） 阅读提示：参见Materials and methods中的Irradiation of xenografts and cells部分 |
| 体内PET/CT成像 | 示踪剂注射途径：静脉注射；PET扫描时间：注射后20-40分钟；[18F]FDG扫描时间：注射后60-80分钟；PK11195预处理剂量：1 mg，i.p.，注射前30分钟 阅读提示：参见Materials and methods中的PET/CT imaging and data analysis部分及Figure 1 |
| 离体生物分布 | 取样时间：注射后40分钟；计算% ID/g、T/B比和M/B比；注意PK11195预处理组可能因血池影响导致肿瘤摄取变化 阅读提示：参见Materials and methods中的Ex vivo tissue counting and autoradiography部分及Figure 4 legend |
| 体外摄取实验 | [18F]F-DPA浓度：0.5 MBq/mL；孵育时间：60分钟；PK11195浓度：10 μM，预孵育30分钟；细胞活力计数；siRNA细胞实验使用低Am（10 GBq/μmol）示踪剂 阅读提示：参见Materials and methods中的In vitro uptake of [18F]F-DPA in FaDu cells部分 |
| 放射性代谢物分析 | 注射后40分钟取样；血浆蛋白沉淀方法；TLC分析条件（如展开剂和检测方法） 阅读提示：参见Materials and methods中的Radiometabolite analyses部分及Figure 5 legend |
| TSPO表达分析 | Western blot蛋白上样量30 μg；抗体稀释比例；RT-qPCR使用引物序列 阅读提示：参见Materials and methods中的Western blot analysis和Real-time quantitative PCR部分 |
| 肿瘤微环境分析 | 肿瘤消化条件：Collagenase D和DNAse 1，37°C孵育45分钟；流式抗体组合；门控策略 阅读提示：参见Materials and methods中的Proportion of monocytes and tumour-associated macrophages部分及Supplementary Fig. 4 |