样本收集与分组
获取分泌中期在位子宫内膜样本,比较子宫内膜异位症不孕女性与正常生育女性的受体表达差异。
收集11例子宫内膜异位症不孕女性和9例无子宫内膜异位症的生育女性的分泌中期在位子宫内膜活检组织。
Aberrant progesterone receptor (PGR) expression is associated with estrogen receptor 1 (ESR1) expression in the endometrium from infertile women with endometriosis
包含免疫组化(IHC)和多重免疫荧光(mIF)两种技术,以及AI辅助单细胞定量分析,但样本量小,且mIF仅分析部分样本,无功能验证或动物实验。
人分泌中期在位子宫内膜组织(来自不孕子宫内膜异位症女性和生育力正常的对照女性) 子宫内膜基质细胞和上皮细胞
分泌中期子宫内膜样本:子宫内膜异位症不孕组(n=11)和对照组(n=9) 免疫组化染色:ESR1抗体(CST #8644)和PGR抗体(CST #8757S)稀释度均为1:500 多重免疫荧光:使用Opal 7色试剂盒,抗体稀释度:CD10 1:100、Pan-Keratin 1:100、ESR1 1:100、PGR 1:200 多重免疫荧光分析样本:对照组3例,子宫内膜异位症组3例(基于上皮PGR强表达选择) AI辅助单细胞定量:使用Visiopharm软件,分析细胞数量(对照组基质4951个、上皮2378个;子宫内膜异位症组基质3593个、上皮2877个)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取分泌中期在位子宫内膜样本,比较子宫内膜异位症不孕女性与正常生育女性的受体表达差异。
收集11例子宫内膜异位症不孕女性和9例无子宫内膜异位症的生育女性的分泌中期在位子宫内膜活检组织。
评估ESR1和PGR在子宫内膜基质和上皮中的表达水平及差异。
对石蜡切片进行抗原修复,一抗孵育,二抗和HRP孵育,DAB显色,苏木素复染,扫描图像并计算H-score。
分析ESR1和PGR表达在基质和上皮中的相关性。
对IHC H-score进行Pearson相关分析。
在单细胞水平验证ESR1和PGR的共表达及其相关性。
选取对照和子宫内膜异位症各3例样本,使用Opal 7色试剂盒进行多重免疫荧光染色,标记Pan-Keratin、CD10、ESR1和PGR,然后扫描并利用Visiopharm软件进行AI辅助单细胞定量分析。
精确量化每个细胞中ESR1和PGR的荧光强度,并评估相关性。
使用Visiopharm软件分割核,计算每个核的平均荧光强度,并进行Pearson相关分析。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | ESR1抗体 | Cell Signaling Technology Inc. | 8644 |
| PGR抗体 | Cell Signaling Technology Inc. | 8757S | |
| 生物素化抗兔IgG | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| HRP标记链霉亲和素 | Invitrogen | 43-4323 | |
| Vectastain Elite DAB试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| 苏木素 | Fisher Scientific Inc. | VMH-032 | |
| PhenoImager HT | Akoya Biosciences | -- | |
| 多重免疫荧光 | Opal 7色免疫组化试剂盒 | Akoya Biosciences | NEL811001KT |
| CD10抗体 | Cell Signaling Technology Inc. | 65534 | |
| Pan-Keratin抗体 | Cell Signaling Technology Inc. | 4545 | |
| ESR1抗体 | Cell Signaling Technology Inc. | 13258 | |
| PGR抗体 | Cell Signaling Technology Inc. | 8757 | |
| Opal抗小鼠和兔HRP | Akoya Biosciences | ARH1001EA | |
| Opal 480 | Akoya Biosciences | FP1500001KT | |
| Opal 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | |
| Opal 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | |
| Opal 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | |
| 光谱DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | |
| ProLong Diamond抗淬灭封片剂 | Invitrogen | P36970 | |
| Phenolmager HT 2.0 | Akoya Biosciences | -- | |
| 免疫组织化学 | 抗原修复液 | Vector Laboratories | -- |
| 正常山羊血清 | Vector Laboratories | S1000-20 | |
| 多重免疫荧光 | 10X AR6缓冲液 | Akoya Biosciences | AR600250ML |
| 1X抗体稀释/封闭液 | Akoya Biosciences | ARD1001EA | |
| 1X Plus手动扩增稀释液 | Akoya Biosciences | FP1498 | |
| 样本处理 | 10%中性缓冲福尔马林 | Epredia | 9400-1 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人子宫内膜样本 | 分泌中期分期标准(Noyes标准)、年龄、月经周期规律性、有无子宫内膜异位症及不孕诊断、激素治疗及宫内节育器使用情况 阅读提示:Materials and methods - Human tissue samples |
| 免疫组化 | 一抗稀释度(ESR1 1:500, PGR 1:500)、抗原修复条件(微波时间/功率)、二抗及HRP孵育时间、DAB显色时间、复染方法 阅读提示:Materials and methods - Immunohistochemistry |
| 多重免疫荧光 | 样本选择标准(上皮PGR强表达)、抗体稀释度(CD10 1:100, Pan-Keratin 1:100, ESR1 1:100, PGR 1:200)、Opal染料稀释度、抗原修复时间(95°C 15分钟)、封闭时间 阅读提示:Materials and methods - Multiplex immunofluorescence |
| AI辅助定量分析 | ROI选择标准(最小腺体大小、存在管腔、无伪影)、核检测算法(Visiopharm App #10169)、荧光强度提取方法(对象级输出变量)、细胞数量 阅读提示:Materials and methods - Quantification Analysis by digital image analysis software |
| 统计分析 | Pearson相关系数计算、t检验类型(非配对双尾)及显著性阈值(p<0.05) 阅读提示:Materials and methods - Statistical analysis |