Abrogation of Oncogenic RAS Signaling by a RAS(ON) Inhibitor Doublet Primes Immune-Refractory KRASG12C-Mutant NSCLC for Immune Checkpoint Blockade
研究涵盖体外细胞实验、CDX和PDX异种移植模型、同基因模型、PDX模型、PK/TE/PD建模、免疫分析等，包含功能验证和机制验证
KRASG12C突变NSCLC细胞系异种移植模型（CDX） KRASG12C突变NSCLC患者来源异种移植模型（PDX） KPAR1.3同基因肺癌模型 3LL-ΔNRAS同基因肺癌模型
RAS(ON)抑制剂双药组合在CDX和PDX模型中的剂量（elironrasib 30-200 mg/kg，daraxonrasib 25 mg/kg） 同基因模型中抗PD-1抗体剂量（10 mg/kg，每周两次） KPAR1.3和3LL-ΔNRAS模型的细胞接种数量和接种部位 免疫细胞耗竭实验中CD4/CD8/NK耗竭抗体的使用方案 长期随访中肿瘤体积测量和CR评估标准
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证双药组合能否在KRASG12C抑制剂单药难治或耐药的模型中产生更深和更持久的肿瘤消退，优于单药。
使用8个KRASG12C突变NSCLC CDX/PDX模型（包括携带TP53、STK11、KEAP1、SMARCA4、CDKN2A等共突变及KRASG12C扩增的模型）进行皮下移植，给予elironrasib（30、100或200 mg/kg）、daraxonrasib（25 mg/kg）单药或联合治疗，每日口服，持续长达90天；同时使用3个临床相关的PDX模型（来自未治疗、ICB耐药、sotorasib耐药患者）验证，并与sotorasib、RMC-4998、RMC-7977及联合治疗比较。
阐明双药组合相比单药能否实现更深且更持久的RAS通路抑制，并影响肿瘤细胞增殖和凋亡。
在NCI-H2122、NCI-H2030异种移植肿瘤和CTG-2536 PDX模型中，单次或多次给药后检测DUSP6 mRNA表达（qPCR）、pERK、pS6、Ki67、cleaved caspase-3表达（IHC），并进行转录组分析（PROGENy/G2M评分）；建立PK/TE/PD模型关联药物浓度、靶点参与和DUSP6表达。
评估双药组合相比单药能否增强抗肿瘤免疫，促进免疫细胞浸润，并与抗PD-1协同产生持久的完全缓解。
在KPAR1.3同基因模型（皮下和原位）中，给予elironrasib或daraxonrasib单药或联合抗PD-1（10 mg/kg）治疗，监测肿瘤生长、CR率；通过免疫组化分析CD4和CD8 T细胞浸润；通过体外实验检测免疫原性细胞死亡标志物（HMGB1释放、CRT暴露）和体内疫苗实验验证免疫原性；通过CD4/CD8/NK细胞耗竭实验验证适应性免疫的必要性。
探究双药组合通过增强MHC I表达和抗原呈递、调节肿瘤微环境来克服ICB耐药，并使免疫难治性肿瘤对anti-PD-1敏感。
在3LL-ΔNRAS同基因模型中，给予elironrasib（30 mg/kg）、daraxonrasib（25 mg/kg）单药或联合治疗，以及联合抗PD-1（10 mg/kg），检测肿瘤生长、CR率；通过流式细胞术分析免疫细胞浸润（CD8、CD4、NK、MDSC、M2巨噬细胞）、MHC I表达；通过免疫组化验证T细胞浸润和GzmB；通过RNA-seq分析抗原呈递相关基因表达；通过TCR测序评估T细胞克隆多样性和收敛性；对完全缓解的小鼠进行再攻击实验。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 胎牛血清 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 细胞工程 | TrueCut V2 Cas9蛋白 | Thermo Fisher Scientific | A36498 |
| 重悬缓冲液R | Thermo Fisher Scientific | MPK1025 | |
| Neon转染系统 | Invitrogen | MPK5000 | |
| 细胞增殖实验 | 3D CellTiter-Glo试剂 | Promega | G9683 |
| SpectraMax M5酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 384孔板 | Corning | -- | |
| CellTiter-Glo 2.0试剂 | Promega | G9243 | |
| 蛋白质印迹 | MSD Tris裂解缓冲液 | MSD | R60TX-2 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| LDS样品缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | NP0008 | |
| 还原剂 | Thermo Fisher Scientific | NP0009 | |
| Western blot | 抗磷酸化p44/42 MAPK (ERK1/2) T202/Y204抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| 抗p44/42 (ERK1/2)抗体 | Cell Signaling Technology | 4696 | |
| 抗磷酸化p90RSK Thr359抗体 | Cell Signaling Technology | 8753 | |
| 抗RSK1/2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 9355 | |
| 抗Vinculin抗体 | Cell Signaling Technology | 13901 | |
| 抗RAS抗体 | Abcam | ab108602 | |
| 山羊抗兔IR800二抗 | LI-COR | 926-32211 | |
| 山羊抗小鼠IR680二抗 | LI-COR | 926-68070 | |
| 免疫原性细胞死亡检测 | 可固定活力染料 | Invitrogen | L34975A |
| 抗CalR抗体 | Cell Signaling Technology | 64678 | |
| Lumit HMGB1免疫检测试剂盒 | Promega | W6110 | |
| 流式细胞术 | Cytek Aurora光谱流式细胞仪 | Cytek Biosciences | -- |
| 体内实验 | NSG小鼠 | Charles River Laboratories | -- |
| C57BL/6小鼠 | The Jackson Laboratory | -- | |
| 抗小鼠PD-1抗体（RMP1-14） | Bio X Cell | -- | |
| 小鼠IgG2a同型对照 | Bio X Cell | -- | |
| ExiTron nano 12000造影剂 | -- | -- | |
| Quantum GX2微型CT成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| 组织学分析 | Bond III自动染色仪 | Leica Biosystems | -- |
| BOND IHC聚合物检测试剂盒 | Leica Biosystems | DS9800 | |
| DAB兔二抗试剂 | Leica Microsystems | DS9800 | |
| 全切片扫描仪 | Leica Microsystems | GT450 | |
| HALO图像分析软件 | Indica Labs | -- | |
| FISH预处理试剂盒 | Abbott Laboratories | 02J06-030 | |
| HCR RNA ISH探针 | Molecular Instruments | -- | |
| EpCAM/广谱细胞角蛋白 | -- | -- | |
| 抗CD4、CD8、颗粒酶B抗体 | -- | -- | |
| Dri肿瘤和组织解离试剂 | BD Biosciences | -- | |
| gentleMACS组织处理器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 小鼠BD Fc阻断剂 | BD Pharmingen | -- | |
| 蓝色死细胞染色试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 免疫测序 | Adaptive免疫测序 | Adaptive Biotechnologies | -- |
| 分子检测 | QIAamp DNA小提试剂盒 | QIAGEN | 51304 |
| DNeasy血液和组织试剂盒 | QIAGEN | 69504 | |
| Naica系统多重数字PCR | Stilla | -- | |
| QuantStudio Absolute Q数字PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| KRAS WT p.G12C突变检测dPCR试剂盒 | APExBIO | AA100902-WT | |
| KRAS突变p.G12C突变检测dPCR试剂盒 | APExBIO | AA100902-MU | |
| Absolute Q液体活检dPCR试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A53732 | |
| RNeasy小提试剂盒 | QIAGEN | 74106 | |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | ABI | 4368813 | |
| TaqMan基因表达预混液 | ABI | 4369542 | |
| DUSP6和18S的TaqMan引物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 质谱分析 | Orbitrap Lumos Eclipse质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SCIEX 6500 Plus三重四极杆质谱仪 | SCIEX | -- | |
| ACQUITY UPLC系统 | Waters | -- | |
| PK分析 | Phoenix WinNonlin软件 | Certara | -- |
| 免疫组化 | Biocare过氧化物酶阻断剂 | Biocare | PX968 |
| 背景消除剂 | Biocare | BP974 | |
| MACH4 HRP聚合物检测系统 | Biocare | M4U534 | |
| Hurton TissueScope LE120全切片扫描仪 | Huron Digital Pathology | -- | |
| KF-PRO-020全切片扫描仪 | KONFOONG | -- | |
| WiSee Biotechnology封闭液 | WiSee Biotechnology | A10015-100 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系异种移植模型 | 细胞系（NCI-H2122、NCI-H2030）的接种细胞数、接种部位和Matrigel比例；治疗起始时肿瘤体积（150-200 mm3） 阅读提示：Methods: Generation of Xenograft Models |
| 患者来源异种移植模型 | PDX模型的建立方法（组织来源、免疫缺陷小鼠品系、传代方式）；治疗起始时肿瘤体积（100-300 mm3） 阅读提示：Methods: Generation of Xenograft Models |
| 同基因模型 | 细胞接种数量（KPAR1.3: 5×10^5；3LL-ΔNRAS: 4×10^5）、Matrigel比例、治疗起始肿瘤体积（KPAR1.3: 250 mm3；3LL-ΔNRAS: 100 mm3） 阅读提示：Methods: Generation of Syngeneic Models |
| 药物处理 | 药物剂量、给药频率、给药途径（口服每日一次）；elironrasib剂量（30-200 mg/kg）、daraxonrasib剂量（25 mg/kg）；抗PD-1剂量（10 mg/kg，腹腔注射，每周两次） 阅读提示：Methods: In Vivo Treatment |
| 疗效评估 | mRECIST标准定义（mCR/mPR/mSD/mPD定义）；肿瘤进展定义（肿瘤体积自基线倍增）；治疗持续时间（最长90天或154天） 阅读提示：Methods: In Vivo Study Data Analysis |
| 机制分析 | 肿瘤收集时间点（如48小时、24小时）；DUSP6 mRNA检测方法（qPCR）；pERK、pS6、Ki67、CC3检测方法（IHC定量）；流式细胞术抗体组合 阅读提示：Methods: DUSP6 qPCR, IHC, Flow Cytometry |
| 免疫学分析 | TCR测序样本收集时间点（24小时）；免疫细胞耗竭实验的抗体给药方案 阅读提示：Methods: TCR Sequencing, In Vivo Treatment |
