比较不同AAV血清型和注射途径的转导效率与特异性
确定最适合膀胱感觉神经元转导的AAV血清型和注射方式，为后续化学遗传学干预提供最优递送方案。
比较了AAV9、PHP.S和AAV-retro经膀胱或鞘内注射后对L6-S1和T13-L1等DRG神经元的转导效率，以及转导的特异性，包括对非膀胱组织和其他DRG节段的影响。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
通过膀胱内注射腺相关病毒-逆行介导的Gi-DREADDs抑制膀胱感觉传入神经可减轻小鼠膀胱过度活动症和疼痛
Inhibition of bladder sensory afferents via intrabladder injection of adenoassociated viruses-retro-mediated Gi-DREADDs alleviates bladder overactivity and pain in mice
实验完整度
高包含体外钙成像验证神经元抑制、正常小鼠行为学与尿动力学检测、急性辣椒素和慢性环磷酰胺疼痛模型的功能与机制验证。
主要模型
雌性C57小鼠 L6-S1 DRG神经元 急性辣椒素膀胱疼痛模型 慢性环磷酰胺膀胱疼痛模型
重点核对
AAV血清型（AAV9、PHP.S、AAV-retro）及注射途径（膀胱注射、鞘内注射）的转导效率与特异性比较 膀胱注射AAV-retro时使用1 × 10^13 vg/mL滴度 CNO剂量为2 mg/kg腹腔注射 行为学评估时间：CNO给药后1小时及24小时洗脱观察 模型诱导：辣椒素30 μM膀胱内灌注，环磷酰胺100 mg/kg腹腔注射3次
摘要
传入神经敏感性增加是膀胱过度活动症（OAB）和间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征的关键病理生理机制。基于Gi-DREADDs的化学遗传学为沉默神经元活动提供了一种新方法。本研究通过选择性沉默膀胱初级感觉神经元，探讨Gi-DREADDs在抑制OAB和疼痛中的转化潜力。所有小鼠均为雌性。比较了3种腺相关病毒（AAV）血清型（AAV9、PHP.S和AAV-retro）经膀胱注射或鞘内注射的转导效率和特异性。膀胱注射的AAV-retro显示出最高的特异性，转导了70%的用逆行示踪剂DiI标记的背根神经节（DRG）神经元。它不转导支配膀胱以外器官的DRG神经元、主要盆腔神经节中的自主神经元和脊髓中的运动神经元。出乎意料的是，膀胱注射的PHP.S未能转导膀胱感觉神经元。使用AAV-retro将hM4D(Gi)递送至膀胱DRG神经元，并用氯氮平-N-氧化物（CNO）激活，在体外显著抑制了DRG神经元对高K+和辣椒素的反应。在体内，用CNO激活AAV-retro介导的hM4D(Gi)在急性（辣椒素）和慢性（环磷酰胺）疼痛模型中均显著缓解了OAB和疼痛行为，且不影响排尿压力或导致尿潴留。这些发现表明，用化学遗传学选择性沉默膀胱感觉神经元对于治疗OAB或慢性膀胱疼痛具有转化潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究通过膀胱内注射AAV-retro递送Gi-DREADDs选择性沉默膀胱感觉神经元，是否能够有效抑制膀胱过度活动症和膀胱疼痛，并评估其转化潜力。
- 核心机制
- AAV-retro经膀胱注射可高效且特异地转导支配膀胱的DRG神经元；激活hM4D(Gi)可抑制膀胱感觉神经元的兴奋性，从而减轻OAB和疼痛。
- 主要证据
- 膀胱注射AAV-retro转导了约70%的DiI标记膀胱DRG神经元，且不转导非膀胱组织；体外钙成像显示CNO激活hM4D(Gi)抑制高K+、辣椒素和Yoda1诱发的反应；在辣椒素和环磷酰胺模型中，CNO改善了排尿频率和痛觉行为。
- 研究意义
- 膀胱注射AAV-retro介导的hM4D(Gi)特异性抑制膀胱感觉传入神经，不损害运动功能或导致尿潴留，为治疗OAB和慢性膀胱疼痛提供了一种有前景的转化策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定AAV-retro转导的膀胱DRG神经元类型
明确AAV-retro优先转导哪些类型的DRG神经元，以理解其对膀胱感觉功能的影响。
使用AAV-retro-CMV-mCherry感染后，根据细胞体直径和神经元标记物（CGRP、NF200、IB4、TRPV1）进行分类，统计各类神经元的转导比例。
体外验证hM4D(Gi)激活对DRG神经元兴奋性的抑制作用
在离体条件下确认AAV-retro-Gi介导的hM4D(Gi)能否有效抑制膀胱感觉神经元的兴奋性。
培养转导AAV-retro-Gi的L6-S1 DRG神经元，通过钙成像检测CNO激活hM4D(Gi)后，对高K+、辣椒素和Yoda1诱发反应的抑制效果。
观察hM4D(Gi)激活对正常小鼠排尿行为及感觉功能的影响
评估抑制膀胱感觉神经元是否影响正常排尿功能，以及是否产生不良反应如尿潴留或运动障碍。
对注射AAV-retro-Gi或对照病毒的小鼠，在CNO注射后1小时及24小时后，通过排尿斑点实验、膀胱测压、Von Frey实验和旷场实验评估排尿频率、压力阈值、机械敏感性和运动功能。
验证hM4D(Gi)激活对急性膀胱疼痛模型的作用
在急性辣椒素诱导的膀胱过度活动和疼痛模型中，评估激活hM4D(Gi)的治疗效果。
建立膀胱内灌注辣椒素诱导的急性疼痛模型，检测CNO处理对排尿行为、自发痛行为（冻结）、机械敏感性和运动功能的影响。
验证hM4D(Gi)激活对慢性膀胱疼痛模型的作用
在慢性环磷酰胺膀胱疼痛模型中，评估激活hM4D(Gi)对OAB和疼痛行为的长期治疗效果。
通过重复腹腔注射环磷酰胺建立慢性膀胱疼痛模型，观察CNO处理对排尿参数、自发痛和机械性痛觉敏感的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
检测神经元功能变化
评估痛觉行为
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒包装 | AAV-retro-CMV-ZsGreen | HanBio | 71092025 |
| AAV9-CMV-ZsGreen | HanBio | 73112226 | |
| AAV-PHP.S-CMV-ZsGreen | HanBio | 81072843 | |
| AAV-retro-hSyn-mCherry-WPRE | OBiO | AOV063 | |
| AAV-retro-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry-WPRE | OBiO | A050475 | |
| 逆行示踪 | DiI | Invitrogen | -- |
| 组织包埋 | O.C.T.冷冻包埋剂 | Scigen | 4586 |
| 免疫荧光 | 抗淬灭封片剂 | Yeasen | 36307ES25 |
| 含DAPI抗淬灭封片剂 | Solarbio | S2110 | |
| 荧光显微镜 | Olympus | BX50 | |
| 细胞培养 | 中性蛋白酶II | -- | -- |
| II型胶原酶 | -- | -- | |
| 最低必需培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| 多聚赖氨酸 | Sigma Aldrich | -- | |
| 钙成像 | Fura 2-AM | Dojindo Laboratories | -- |
| Hank平衡盐溶液 | -- | -- | |
| 尼康显微镜 | Nikon | Eclipse Ti | |
| Mateflour成像软件 | -- | -- | |
| 排尿斑点实验 | Whatman实验台垫 | Whatman | 2300-917 |
| 膀胱测压 | PE-50管 | -- | -- |
| 压力传感器 | AD Instruments | -- | |
| 数据采集系统 | AD Instruments | -- | |
| 行为学分析 | Visu Track | Xinruan | -- |
| 统计分析 | Prism 10 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AAV转导效率与特异性比较 | AAV血清型（AAV9、PHP.S、AAV-retro），注射途径（膀胱注射、鞘内注射），病毒滴度（1×10^11、1×10^12、1×10^13 vg/mL），评估时间点（4、6、8周） 阅读提示：2.2 Viruses, 2.3 Bladder injection, 2.4 Intrathecal injection, 3.1, 3.2, 3.3 |
| DRG神经元类型鉴定 | 细胞体直径分类（小<20 μm，中20-25 μm，大>25 μm）及标记物（CGRP、NF200、IB4、TRPV1） 阅读提示：3.4 |
| 体外功能验证 | CMO浓度（2.5 μM），刺激剂（KCl 30 mM、capsaicin 500 nM、Yoda1 3 μM），重复刺激方案（3次，间隔15分钟） 阅读提示：2.7 Calcium imaging, 3.5 |
| 正常小鼠行为学与尿动力学检测 | CNO剂量（2 mg/kg, i.p），评估时间（CNO后1小时和24小时），排尿斑点实验时长（4小时），膀胱测压灌流速度（0.01 mL/min） 阅读提示：2.8, 2.9, 3.6 |
| 急性膀胱疼痛模型 | 辣椒素剂量（30 μM，膀胱内灌注），分组（NS+NS, Cap+NS, Cap+CNO），CNO剂量（2 mg/kg, i.p） 阅读提示：3.7 |
| 慢性膀胱疼痛模型 | 环磷酰胺剂量（100 mg/kg, i.p, 3次），CNO剂量（2 mg/kg, i.p） 阅读提示：3.8 |