HOXD13在黑色素瘤中的表达分析
确定HOXD13在黑色素瘤中相对于痣和其他癌症类型的表达水平及其与临床特征的相关性
分析转录组数据集（Badal等）、TCGA、GTEx、ICGC等公共数据，利用RNAscope在组织微阵列上验证蛋白表达，并检查不同细胞系中的表达水平。
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可靶向的发育程序共同调控黑色素瘤中的血管生成与免疫逃逸
A Targetable Developmental Program Coregulates Angiogenesis and Immune Evasion in Melanoma
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、体内异种移植与同系小鼠模型、3D染色质分析（Hi-ChIP）、转录组学及患者样本验证，并进行了功能回补和药物联合干预实验，具备多层级证据。
主要模型
A375、SKMEL-5人类黑色素瘤细胞系异种移植模型（NSG小鼠） B16F10、YUMM1.7、D4M-3A小鼠黑色素瘤同系移植模型（C57BL/6J小鼠） 患者黑色素瘤组织微阵列（TMA）及scRNA-seq样本
重点核对
HOXD13敲低或过表达对肿瘤生长的影响（A375、SKMEL-5、B16F10、YUMM1.7、D4M-3A） HOXD13调控VEGFA、SEMA3A、NT5E(CD73)表达的验证（RNA-seq、ELISA、Western blot） HOXD13对T细胞杀伤和肿瘤浸润的影响（OT-I T细胞共培养、JurkatNY-ESO共培养、mIF） 联合使用lenvatinib和etrumadenant对HOXD13过表达肿瘤的治疗效果（C57BL/6J小鼠） HOXD13表达与患者CTL评分及ICI反应的相关性（TCGA、scRNA-seq、空间转录组）
摘要
紫外线诱导的DNA突变产生了皮肤黑色素瘤的遗传驱动因素和大量可触发抗肿瘤免疫的新抗原。因此，黑色素瘤细胞必须通过调节细胞自主的表观遗传机制和肿瘤-微环境相互作用来迅速逃避免疫检测。尽管血管生成通常促进免疫细胞浸润，但实体瘤在增加血管化的同时却限制免疫细胞进入。通过比较早期黑色素瘤、痣和其他癌症中转录因子（TF）的表达，我们发现同源框转录因子HOXD13驱动一种在黑色素瘤中上调的类黑色素母细胞程序，并与血管生成和免疫细胞排斥密切相关。利用转录组学、3D染色质谱分析和体内模型，我们证明HOXD13通过增强血管生成和抑制T细胞浸润来促进肿瘤生长。HOXD13协调3D增强子-启动子接触，激活VEGFA、SEMA3A和NT5E（CD73），这些基因重塑血管系统并升高免疫抑制性腺苷。一致地，HOXD13诱导的肿瘤生长可被VEGFR和腺苷受体（AdR）抑制剂的联合抑制所逆转，揭示了一个具有治疗相关性的双促血管生成和免疫抑制HOXD13轴。意义：免疫逃逸导致癌症进展和对免疫治疗反应不佳。我们报告了一种由转录因子HOXD13主导的新型表观遗传机制，使黑色素瘤细胞能够同时抑制和排斥T细胞，这可以通过使用VEGF和AdR抑制剂进行治疗性对抗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 黑色素瘤细胞如何同时激活血管生成并抑制免疫细胞浸润，其分子机制及可靶向性如何？
- 核心机制
- HOXD13通过结合远端增强子，建立3D染色质环，激活VEGFA、SEMA3A和NT5E(CD73)的表达，从而促进病理性血管生成并增加细胞外腺苷水平，抑制T细胞浸润和功能，实现免疫逃逸。
- 主要证据
- 体外细胞实验、异种移植和同系小鼠模型、H3K27ac Hi-ChIP和RNA-seq显示HOXD13调控血管生成和免疫相关基因；过表达HOXD13增加肿瘤生长并减少T细胞浸润，而联合VEGFR和腺苷受体抑制剂可逆转其促肿瘤效应。
- 研究意义
- 该研究揭示了一个由HOXD13驱动的、同时促进血管生成和免疫抑制的发育程序，为HOXD13阳性的免疫冷肿瘤（包括肢端黑色素瘤）提供了联合靶向VEGF和腺苷通路的治疗策略依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HOXD13的体外功能研究
评估HOXD13对黑色素瘤细胞增殖和存活的影响
使用siRNA敲低A375和501mel细胞中的HOXD13，通过生长曲线和流式细胞术检测细胞凋亡。
体内肿瘤生长实验
验证HOXD13对体内肿瘤生长的影响
将稳定表达shRNA的A375、SKMEL-5、B16F10细胞皮下植入免疫缺陷或同系小鼠，测量肿瘤体积和重量。
HOXD13的基因组靶标鉴定
在全基因组范围内鉴定HOXD13的结合位点及其调控的靶基因
在A375细胞中进行ChIPmentation和H3K27ac Hi-ChIP，结合RNA-seq分析，确定HOXD13的结合位点和受其调控的基因。
HOXD13对血管生成的影响
阐明HOXD13是否通过调控VEGFA和SEMA3A影响肿瘤血管生成
通过ELISA检测分泌的VEGFA，利用多重免疫荧光（mIF）分析肿瘤血管（CD31和α-SMA），并进行scRNA-seq分析肿瘤微环境中的内皮细胞和周细胞。
HOXD13对免疫逃逸的影响
验证HOXD13是否通过抑制T细胞功能促进免疫逃逸
利用OVA抗原系统和OT-I T细胞共培养模型、JurkatNY-ESO共培养系统以及同系小鼠模型，检测HOXD13对T细胞杀伤和肿瘤浸润的影响。
联合靶向治疗实验
评估同时阻断VEGF和腺苷通路是否能逆转HOXD13介导的肿瘤生长优势
在YUMM1.7 HOXD13过表达肿瘤模型中，单独或联合给予lenvatinib和etrumadenant，评估肿瘤生长和肿瘤微环境变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Ham's F-10培养基 | PromoCell | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 12657029 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| 霍乱毒素 | -- | -- | |
| 人干细胞因子 | -- | -- | |
| 内皮素-1 | -- | -- | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| 支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-703 | |
| 支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07–710 | |
| 细胞转染与感染 | LT3GEPIR慢病毒载体 | Addgene | 111177 |
| pCW57-MCS1-2A-MCS2慢病毒载体 | Addgene | 71782 | |
| pLVX-puro-cOVA慢病毒载体 | Addgene | 135073 | |
| LV-RFP慢病毒载体 | Addgene | 26001 | |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| FuGENE6转染试剂 | Promega | E2691 | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778150 | |
| T细胞分离 | ACK裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | A1049201 |
| OVA多肽257-264 | GenScript | RP10611 | |
| 人白细胞介素-2 | STEMCELL Technologies | 78036 | |
| T细胞共培养 | CellTrace Violet细胞染料 | Thermo Fisher Scientific | C34557 |
| 抗CD3抗体 | Thermo Fisher Scientific | 16-0038-85 | |
| 抗CD28抗体 | Thermo Fisher Scientific | 16-0289-85 | |
| 白细胞介素-2 | STEMCELL Technologies | 78036 | |
| 干扰素-γ | -- | -- | |
| ELISA | 腺苷检测试剂盒 | Abcam | ab211094 |
| VEGF Quantikine ELISA试剂盒 | R&D Systems | DVE00 | |
| 0.45微米针式过滤器 | Corning | 431220 | |
| 无酚红DMEM培养基 | Gibco | 21063-029 | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC | BD | 556420 |
| 碘化丙啶 | BD | 556463 | |
| 抗人CD73抗体 | BioLegend | 127212 | |
| 抗小鼠CD73抗体 | BioLegend | 344012 | |
| qRT-PCR | NucleoSpin RNA Plus提取试剂盒 | Macherey-Nagel | 790498.250 |
| SuperScript IV反转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 18090200 | |
| PowerSYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | 4309155 | |
| SuperScript II反转录试剂盒 | Invitrogen | 18064014 | |
| RNeasy Plus RNA提取试剂盒 | QIAGEN | 74134 | |
| Western blot | NuPAGE 4%-12%梯度凝胶 | Thermo Fisher Scientific | NP0322BOX, |
| 硝酸纤维素膜 | Cytiva | 10600011 | |
| 肿瘤解离 | Hanks平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | H6648 |
| I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C2674 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Worthington | LS002138 | |
| 70微米细胞过滤器 | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 40微米细胞过滤器 | Fisher Scientific | 22363547 | |
| PE偶联CD45抗体 | BioLegend | mouse | |
| PIPseq | PIPseq T20 3'单细胞RNA试剂盒4.0PLUS版本 | Fluent BioSciences | -- |
| 高灵敏度DNA分析试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| 高灵敏度D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | -- | |
| NovaSeq X+ 10B 200循环流动槽 | Illumina | -- | |
| 免疫荧光与免疫组化 | 福尔马林固定液 | EKI-Chem | 2406420 |
| Paraplast X-tra石蜡 | Leica | 39603002 | |
| 伊红 | Leica | 3801619 | |
| 抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724S | |
| Leica BOND聚合物检测系统 | Leica | DS9800 | |
| 兔抗啮齿动物HRP聚合物 | Biocare | RMR622 | |
| 光谱DAPI染色液 | Akoya Biosciences | FP1490 | |
| ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| RNAscope | RNAscope多重荧光试剂盒版本2 | Bio-Techne | 323110 |
| 人HOXD13 RNAscope探针 | Bio-Techne | 489291 | |
| MITF RNAscope探针 | Bio-Techne | 310951 | |
| 组织微阵列ME2082d | tissuearray.com | ME2082d | |
| ChIP-seq, ChIPmentation, Hi-ChIP, HiC | 甲醛 | Sigma-Aldrich | 47608 |
| 乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯) | Thermo Fisher Scientific | 21565 | |
| H3K27ac抗体 | Active Motif | 91193 | |
| IgG对照抗体 | Cell Signaling Technology | 3900 | |
| Protein A/G磁珠 | Pierce Thermo Fisher Scientific | 88803 | |
| MinElute反应纯化试剂盒 | QIAGEN | 28204 | |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | NEB | E7600S | |
| DNA片段化酶 | Illumina | 20034197 | |
| Arima-HiC+试剂盒 | Arima Genomics | A101020, | |
| omniATACseq | 脱氧核糖核酸酶 | Worthington | LS002007 |
| 转座酶 | Illumina | 20034197 | |
| DNA清洁和浓缩试剂盒-5 | Zymo Research | D4014 | |
| CUT&Tag | CUT&Tag-IT试剂盒 | Active Motif | 53160 |
| 动物实验 | Matrigel基质胶 | Corning | 354234 |
| 仑伐替尼 | MedChemExpress | HY-10981 | |
| Etrumadenant | MedChemExpress | HY-129393 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 黑色素瘤细胞系（A375, SKMEL-5, B16F10等）的培养条件，包括培养基、血清、添加物（如TPA、霍乱毒素、hSCF、EDN-1）及CO2浓度 阅读提示：Methods - Cell Culture |
| HOXD13敲低/过表达 | shRNA序列、慢病毒载体、感染复数（MOI）、doxycycline诱导浓度（1 μg/mL）和时间（至少48小时）；siRNA转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX）及siRNA浓度（25 nmol/L） 阅读提示：Methods - Cell Transfection and Lentiviral Infection |
| 体内肿瘤生长实验 | 小鼠品系（NSG或C57BL/6J）、年龄（8周龄）、性别（雄性）、注射细胞数（1×10^5）、注射方式（皮内）、基质胶比例（50% PBS + 50% Matrigel）、肿瘤体积测量频率（每2-3天）及最大允许肿瘤体积（1,500 mm^3） 阅读提示：Methods - Mouse Experiments |
| T细胞杀伤实验 | 共培养体系中肿瘤细胞与T细胞的比例（1:10）、OT-I T细胞的分离和激活方法、共培养时间（24-72小时）、IFNγ处理浓度（20 ng/mL）及检测方法（Annexin V染色） 阅读提示：Methods - Murine and Human Melanoma Cells Coculture with T Cells |
| 药物处理实验 | lenvatinib和etrumadenant的给药剂量（10 μg/g和100 μg/g）、给药方式（口服灌胃）、给药频率（每日一次）、起始时间（移植后3天）及溶剂（95% corn oil + 5% DMSO） 阅读提示：Methods - Mouse Experiments |