lncRNA候选筛选与鉴定
鉴定响应T细胞激活且与CeD相关GWAS变异重叠的lncRNA候选。
分析人类CeD小肠麸质特异性CD4+ T细胞TCR刺激后的RNA表达，筛选差异表达lncRNAs，并与CeD GWAS SNPs重叠，最终确定lnc13为候选。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
长链非编码RNA lnc13抑制炎症反应以维持对麸质的口服耐受
The long noncoding RNA lnc13 restrains inflammatory responses to maintain oral tolerance to gluten
实验完整度
高包含lncRNA筛选、体外细胞刺激、lnc13敲除小鼠模型、体内麸质攻击、组织学分析、RNA-seq、RAP-DNA-seq及人类样本验证等多个独立证据层级，并进行功能与机制验证。
主要模型
HLA-DQ8转基因小鼠（lnc13−/−-DQ8和WT-DQ8） 小鼠CD8α+上皮内淋巴细胞（IELs） 人类外周血CD8+ T细胞 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）
重点核对
lnc13敲除小鼠与HLA-DQ8转基因小鼠的杂交及基因型确认 麸质攻击方案：10周龄起更换含麸质饮食，并每隔一天灌胃20mg麦醇溶蛋白，持续45天 关键检测指标：小肠固有层和上皮内淋巴细胞中IFN-γ、IL-12、GZMB、NKG2D、CD107a/b等表达 组织学评估：绒毛-隐窝比例、隐窝深度、上皮内淋巴细胞计数及绒毛萎缩评分
摘要
乳糜泻（CeD）是一种由膳食麸质触发的自身免疫性疾病。虽然HLA-DQ2/8介导的麦醇溶蛋白肽呈递是疾病所必需的，但麸质口服耐受丧失的机制仍不完全清楚。长链非编码RNA（lncRNA）越来越被认为是免疫功能的调节因子，但其在口服耐受中的作用此前尚未被探索。在此，通过一项旨在鉴定响应T细胞激活且富集CeD相关GWAS变异的lncRNA的筛选，我们将lnc13确定为最佳候选。在缺乏lnc13的HLA-DQ8转基因小鼠中，未经处理的麸质摄入导致了类似于人类CeD的分子特征和麸质口服耐受丧失的标志性特征：小肠中IFN-γ+淋巴细胞、IL-12+髓系细胞、细胞毒性上皮内免疫细胞增加以及隐窝增生。机制上，lnc13结合特定的DNA调控区域并限制免疫细胞对促炎信号的响应性。特别是，lnc13抑制IL-15驱动的CD8+自然杀伤样淋巴因子激活杀伤细胞的分化（这是与CeD密切相关的IL-15依赖性通路）。这些发现确立了lnc13作为麸质口服耐受的关键非编码调节因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 长链非编码RNA lnc13是否以及如何调节对膳食麸质的口服耐受？
- 核心机制
- lnc13通过结合特定DNA调控元件（如Maf、Cxxc5、Gab2等基因座），可能招募NuRD复合物，抑制IL-15反应基因的表达，从而限制CD8+上皮内淋巴细胞对IL-15信号的响应性，阻止其向细胞毒性NK样淋巴因子激活杀伤细胞分化。
- 主要证据
- 在HLA-DQ8转基因小鼠中敲除lnc13后，麸质攻击导致IFN-γ+CD4+/CD8+ T细胞、IL-12+髓系细胞增加，CD8+ IELs表达GZMB、NKG2D、CD107a/b等细胞毒性标志物升高，并出现隐窝增生等CeD样病理；体外实验证实lnc13缺失增强IL-15SA诱导的NKG2D+GZMB+细胞分化；RAP-DNA-seq显示lnc13结合多个IL-15反应基因的调控区域。
- 研究意义
- 该研究揭示了lnc13作为非编码调节因子在维持麸质口服耐受中的关键作用，为理解CeD的遗传易感性和发病机制提供了新视角，并建立了lnc13−/−-DQ8小鼠作为研究CeD早期病理的遗传模型。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
lnc13表达调控分析
探究lnc13在T细胞激活后的表达动态及其转录调控机制。
通过公共ChIP-seq数据分析转录因子结合，并使用Rela条件敲除小鼠验证NF-κB对lnc13表达的调控作用。
lnc13敲除小鼠的生成与验证
生成lnc13全敲除小鼠并验证敲除特异性，用于后续体内功能研究。
使用CRISPR-Cas9技术删除小鼠lnc13基因体（约2.4kb），不破坏邻近Il18rap基因，并进行基因型鉴定和邻近基因表达验证。
体内麸质攻击模型
在HLA-DQ8转基因小鼠中评估lnc13缺失对麸质口服耐受的影响。
将lnc13敲除小鼠与HLA-DQ8转基因小鼠杂交，小鼠断奶后喂食无麸质饮食至10周龄，随后转为含麸质标准饮食，并每隔一天灌胃20mg麦醇溶蛋白，持续45天。
免疫表型分析
分析lnc13缺失对麸质攻击后肠道免疫细胞组成和功能的影响。
通过流式细胞术检测小肠固有层和上皮内淋巴细胞中T细胞、髓系细胞、NK细胞等的频率和标志物表达，包括IFN-γ、IL-12、FOXP3、GZMB、NKG2D、CD107a/b等。
转录组分析
比较lnc13缺失小鼠与人类CeD患者的转录组变化，评估模型的临床相关性。
对全小肠组织、LPLs、IELs及分选的CD8αβ+ IELs进行RNA-seq，并进行通路富集分析和跨物种DEG比较。
组织病理学评估
评估lnc13缺失对麸质攻击后小肠组织学结构的影响。
制备回肠及全小肠瑞士卷切片，进行H&E染色，测量绒毛-隐窝比例、隐窝深度、上皮内淋巴细胞数量，并进行绒毛萎缩评分。
体外IL-15刺激实验
探究lnc13在CD8+ IELs中对IL-15信号响应的调控作用。
分离小鼠CD8+ IELs，使用可溶性IL-15或IL-15超级激动剂（IL-15SA）刺激，检测lnc13及Dcp2表达变化，并评估NKG2D、GZMB等标志物表达。
机制研究
阐明lnc13调控CD8+ T细胞IL-15反应性的分子机制。
通过RNA-seq分析lnc13缺失对IL-15刺激后基因表达的影响，进行TF motif分析，并利用RAP-DNA-seq定位lnc13在基因组上的结合位点。
人类样本验证
验证lnc13在人类CD8+ T细胞中的功能保守性。
在人类外周血CD8+ T细胞亚群（naive、EM、CM）中检测lnc13表达，并通过siRNA敲低lnc13后观察IL-15刺激下靶基因表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 麸质攻击 | 粗制麦醇溶蛋白 | Sigma | G3375 |
| 细胞培养 | 脂多糖 | Sigma | L8274 |
| 重组小鼠IL-15 | PeproTech | 210-15 | |
| IL-15超级激动剂 | Sino Biological | CT113-M08H | |
| 流式细胞术 | 抗CD45.2 BV786抗体 | BD Biosciences | 563686 |
| 抗TCRβ BV711抗体 | BD Biosciences | 563135 | |
| 抗IFN-γ PE-Cy7抗体 | Tonbo Biosciences | 60-7311 | |
| 抗GZMB FITC抗体 | BioLegend | 515403 | |
| Live-or-Dye 350/488死活细胞染色试剂盒 | Biotium | -- | |
| eBioscience IC固定缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 00-8222-49 | |
| eBioscience破膜缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 00-8333-56 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Quick-RNA微型制备试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| cDNA合成 | GoScript逆转录酶试剂盒 | Promega | -- |
| qPCR | Luna通用qPCR预混液 | NEB | M3003E |
| RNA-seq文库制备 | NEBNext Ultra II RNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| NEBNext单细胞/低投入RNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| RAP | 链霉亲和素磁珠 | -- | -- |
| ELISA | 辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG抗体 | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 |
| OptEIA试剂套装A | BD Biosciences | 550536 | |
| 小鼠TNF ELISA试剂盒 | BD Biosciences | 560478 | |
| 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | BD Biosciences | 555138 | |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | BD Biosciences | 555240 | |
| 小鼠CRP ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10085 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系：lnc13−/−-DQ8和WT-DQ8（C57BL/6J背景，HLA-DQ8转基因且缺乏内源性MHC-II）；年龄匹配和同笼饲养 阅读提示：Methods: Mouse |
| 麸质攻击 | 饮食方案：断奶后无麸质饮食（AIN-76A）至10周龄，后转为含麸质标准饮食；灌胃：20mg粗制麦醇溶蛋白（Sigma G3375）每隔一天，持续45天 阅读提示：Methods: Gluten challenge, Fig. 2a |
| 流式细胞术分析 | 组织处理：IEL和LPL制备方法（包括EDTA、DTT、Percoll等）；细胞刺激：PMA/离子霉素/BFA 4小时（检测CD107a/b时加入抗体）；抗体克隆号及荧光素 阅读提示：Methods: IEL and LPL preparation, Flow cytometry |
| 组织学评估 | 组织固定：10%中性缓冲福尔马林24-48小时；染色：H&E；测量指标：绒毛-隐窝比例、隐窝深度、IEL计数；评分：绒毛萎缩评分（0-2分）由病理学家盲法进行 阅读提示：Methods: Histology analysis |
| 体外IL-15刺激 | 细胞来源：小肠CD8α+ IELs；刺激条件：100 ng/ml可溶性IL-15或IL-15SA，48小时或5天；检测指标：lnc13、Dcp2表达，NKG2D、GZMB等 阅读提示：Methods: Cell culture, Fig. 5 |