建立获得性耐药PDX模型并鉴定乳酸化变化
探索贝伐珠单抗耐药相关的蛋白乳酸化变化
通过连续使用贝伐珠单抗处理PDX肿瘤建立获得性耐药模型，并进行蛋白质组学和乳酸化组学分析，比较耐药与敏感PDX肿瘤的乳酸化水平和VM形成。
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PKM2乳酸化通过促进FOSL1超级增强子形成介导结直肠癌血管生成拟态及贝伐珠单抗耐药
PKM2 Lactylation Promotes Colorectal Cancer Vasculogenic Mimicry and Bevacizumab Resistance by Facilitating FOSL1 Super-enhancer Formation
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、体内CDX/PDX模型、患者样本和PDO模型，并有机制验证（CUT&Tag、ChIP-qPCR，Co-IP等）
主要模型
结直肠癌细胞系HCT116和SW620 结直肠癌CDX异种移植模型 结直肠癌PDX异种移植模型 结直肠癌患者来源类器官（PDO）
重点核对
PKM2 K206乳酸化位点 AARS1作为乳酸化writer FOSL1及其超级增强子形成 贝伐珠单抗处理剂量及方案
摘要
尽管贝伐珠单抗在晚期结直肠癌中具有临床效用，但耐药性仍然是一个重大挑战。在本研究中，我们揭示了一种由乳酸介导的机制，该机制通过PKM2乳酸化驱动血管生成拟态（VM）和贝伐珠单抗耐药。AARS1介导的PKM2在K206位点的乳酸化促进了PKM2核转位及其与FOSL1的相互作用。PKM2结合促进了FOSL1依赖的超级增强子形成和靶基因转录，这有助于结直肠癌细胞的血管生成拟态。对PKM2乳酸化的遗传或药理学抑制破坏了血管生成拟态，并在患者来源的临床前模型中与贝伐珠单抗协同作用，显著提高了治疗效果。总之，本研究揭示了乳酸化作为一种代谢开关，将癌症糖酵解重编程与转录重连联系起来，并提出了靶向PKM2乳酸化以增强贝伐珠单抗在结直肠癌中的抗肿瘤活性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PKM2乳酸化如何促进结直肠癌的血管生成拟态及贝伐珠单抗耐药？
- 核心机制
- AARS1介导PKM2 K206乳酸化，促进PKM2核转位并与FOSL1相互作用，进而形成FOSL1依赖的超级增强子，上调下游靶基因（如SNAI2, MYC, MAZ）转录，增强癌症干性和血管生成拟态，导致贝伐珠单抗耐药。
- 主要证据
- 体外细胞功能实验、体内CDX/PDX模型、患者样本和类器官（PDO）实验证实抑制PKM2乳酸化可抑制血管生成拟态并增强贝伐珠单抗疗效。蛋白组/乳酸化组、CUT&Tag、ChIP-qPCR验证了机制。
- 研究意义
- 本研究揭示了乳酸化将糖酵解重编程与转录重连联系起来，并提出靶向PKM2乳酸化可能作为提高贝伐珠单抗在结直肠癌中临床疗效的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PKM2乳酸化及其writer
确定PKM2乳酸化的关键位点及催化酶
通过shRNA文库筛选、体外乳酸化实验、质谱鉴定，验证AARS1是PKM2乳酸化的writer，并确定K206为主要位点。
评估PKM2 K206乳酸化的功能
验证PKM2 K206乳酸化对细胞增殖、干性、血管生成拟态的影响
构建PKM2 WT和K206R突变细胞系，通过CCK8、集落形成、软琼脂集落、管形成、凋亡等实验比较功能差异。
研究PKM2核转位机制
探讨K206乳酸化如何促进PKM2核转位
通过细胞分级、免疫荧光、Co-IP等实验，验证K206乳酸化促进importin α5招募，独立于ERK1/2磷酸化。
验证PKM2与FOSL1相互作用及超级增强子形成
探讨核内PKM2与FOSL1的作用及对超级增强子的影响
通过Co-IP、CUT&Tag、ATAC-seq分析PKM2和FOSL1的共定位及对FOSL1依赖的超级增强子形成的影响。
评估联合抑制策略的体内外疗效
验证抑制PKM2乳酸化或FOSL1超级增强子能否增强贝伐珠单抗疗效
在PDO和PDX模型中，使用oxamate、β-alanine、GSK-J4单独或与贝伐珠单抗联用，评估肿瘤生长和血管生成拟态。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013F |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78446 | |
| 抗泛乳酸化抗体 | Jingjie | PTM-1401RM | |
| 抗PKM2抗体 | Cell Signaling Technology | 4053 | |
| 抗PKM2 K206乳酸化抗体 | Jingjie | -- | |
| 抗AARS1抗体 | ABclonal | A15017 | |
| 抗FOSL1抗体 | Abcam | ab252421 | |
| 抗importin α5抗体 | Abcam | ab187175 | |
| 抗H3K27ac抗体 | -- | -- | |
| 免疫组织化学 | 抗CD31抗体 | Proteintech | 11265-1-AP |
| 免疫荧光 | 抗Ki-67抗体 | Abcam | ab16667 |
| 抗SOX2抗体 | Abcam | ab93689 | |
| 抗NANOG抗体 | Cell Signaling Technology | 4903 | |
| 抗OCT4抗体 | Cell Signaling Technology | 2750 | |
| 抗Snail抗体 | Cell Signaling Technology | 3879 | |
| 抗E-cadherin抗体 | Cell Signaling Technology | 3195 | |
| 抗vimentin抗体 | Cell Signaling Technology | 5741 | |
| 抗PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 9532 | |
| 抗磷酸化PKM2 (S37)抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5105500 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗HK2抗体 | Cell Signaling Technology | 2867 | |
| 抗PFKFB3抗体 | Abcam | ab181861 | |
| 抗LDHA抗体 | Proteintech | 19987-1-AP | |
| 抗SLC16A3抗体 | Proteintech | 22787-1-AP | |
| 抗泛乙酰化抗体 | Cell Signaling Technology | 9441 | |
| 抗P300抗体 | Abcam | ab275378 | |
| 抗SIRT1抗体 | Cell Signaling Technology | 8469 | |
| 抗SNAI2抗体 | Cell Signaling Technology | 9585 | |
| 抗MAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 90940 | |
| 抗FLAG标签抗体 | Proteintech | 60002-1-Ig | |
| 抗HA标签抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 抗lamin A抗体 | Proteintech | 10298-1-AP | |
| 抗β-tubulin抗体 | Proteintech | 10068-1-AP | |
| FITC标记二抗 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 管形成实验 | 基质胶 | Corning | 356231 |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | DOJINDO | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI染色试剂盒 | BD Pharmingen | 556547 |
| 免疫共沉淀 | Pierce经典磁性IP/Co-IP试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88804 |
| ChIP实验 | Pierce磁性ChIP试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 26157 |
| 蛋白A/G磁珠 | MedChemExpress | HY-K0202 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa Bio | RR037A |
| SYBR Green PCR预混液 | Life Technologies | -- | |
| CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| RNA测序 | Illumina HiSeq3000测序平台 | Illumina | -- |
| ATAC-seq | DNA纯化浓缩试剂盒 | Zymo | -- |
| Nextera DNA CD索引 | Illumina | -- | |
| NEBNext Ultra II Q5预混液 | NEB | -- | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| CUT&Tag | 伴刀豆球蛋白A包被磁珠 | Bangs Laboratories | -- |
| 类器官培养 | 人肠类器官培养基 | STEMCELL Technologies | 06010 |
| 胶原酶 | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 脱氧核糖核酸酶 | Sigma-Aldrich | 18047019 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | 5092280001 | |
| TrypLE Express酶 | Gibco | 12604013 | |
| 类器官活力检测 | CellTiter-Glo 3D细胞活力检测试剂盒 | Promega | G9682-1 |
| 乳酸测定 | 比色法乳酸检测试剂盒 | Solarbio | YZ-K-LATE |
| PK活性测定 | PK活性比色法检测试剂盒 | Biovision | -- |
| 代谢分析 | Seahorse XF96代谢分析仪 | Bioscience | -- |
| ECAR测定 | 2-脱氧-D-葡萄糖 | -- | -- |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 乳酸 | -- | -- |
| 乳酸钠 | -- | -- | |
| 二甲基乙二酰甘氨酸 | -- | -- | |
| 草氨酸盐 | -- | -- | |
| β-丙氨酸 | -- | -- | |
| GSK-J4 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 体内治疗 | 贝伐珠单抗 | -- | -- |
| 转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus | 101000046 |
| 蛋白质表达 | 异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷 | -- | -- |
| 蛋白质纯化 | 谷胱甘肽琼脂糖珠 | Amersham Biosciences | -- |
| 分子生物学 | pGEX-4T-2载体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源及培养条件（如ATCC货号、培养基成分、FBS浓度、抗生素浓度）、低氧条件（1%氧气） 阅读提示：Materials and Methods, Cell lines and cell cultures |
| 乳酸化检测 | 抗体（pan-Kla, PKM2 K206la）及使用浓度、细胞处理（乳酸、Nala、DMOG、oxamate、β-alanine的浓度和时间） 阅读提示：Materials and Methods, Western blot analysis |
| PDX模型建立 | 患者肿瘤样本来源、小鼠品系（NOD/SCID）、贝伐珠单抗剂量和给药方案（5 mg/kg每3天）、耐药PDX的传代方式 阅读提示：Materials and Methods, In vivo therapeutic study; Figure 1A |
| PDO培养 | 肿瘤组织处理（消化酶）、Matrigel包被、培养基（IntestiCult OGM）、Y-27632浓度、药物处理（DMOG、oxamate、β-alanine、GSK-J4）及时间 阅读提示：Materials and Methods, Organoid culture |
| 机制研究 | CUT&Tag实验条件（抗体、细胞数、转座酶）、ATAC-seq条件、ChIP-qPCR引物序列 阅读提示：Materials and Methods, CUT&Tag and ATAC-seq |