ISG15表达分析
评估ISG15在正常和纤维化肝脏中的表达变化。
利用scRNA-seq数据分析小鼠肝脏中ISG15表达，并在小鼠和人类纤维化肝脏样本中通过qPCR、Western blot、免疫荧光和免疫组化验证ISG15表达。
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肝星状细胞中ISG15缺失通过抵消CREB1的ISG化修饰促进TGFβ2诱导的肝纤维化
ISG15 deficiency in hepatic stellate cells promotes TGFβ2-induced liver fibrosis by counteracting CREB1 ISGylation
实验完整度
高包含体外细胞模型（LX-2、原代人HSC）、体内动物模型（CCl4、BDL、CDAHFD、自发衰老模型）以及人肝样本，并进行了功能验证和机制研究。
主要模型
LX-2人肝星状细胞系 原代人肝星状细胞 HSC特异性ISG15敲除小鼠 CCl4/BDL诱导肝纤维化小鼠模型 人肝硬化肝组织
重点核对
ISG15cKO小鼠为Lrat-Cre介导的HSC特异性敲除 CCl4模型为8周CCl4注射，BDL模型为3周胆管结扎，CDAHFD模型为6周饮食；666-15给药剂量为10 mg/kg，腹腔注射，每周两次；AAV尾静脉注射 体外实验中LX-2和原代HSC用siRNA或shRNA敲低ISG15/UBE2L6/USP18，或用CRISPR/Cas9敲除ISG15 关键检测包括羟脯氨酸含量、ALT/AST、Western blot、qPCR、组织染色（H&E、天狼星红、Masson）、免疫染色（αSMA、F4/80、Ly6G）、ChIP-qPCR、双荧光素酶报告实验、免疫沉淀、SPR 统计学显著阈值* p<0.05，** p<0.01
摘要
背景：干扰素刺激基因15（ISG15）是干扰素通路的下游分子，对许多细胞过程至关重要。ISG15主要通过一种称为ISG化的翻译后修饰过程发挥其功能。目的：本研究探讨了ISG15在肝星状细胞（HSCs）活化和肝纤维化中的作用。设计：通过四氯化碳（CCl4）、胆管结扎（BDL）手术和代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）饮食在HSC特异性缺失ISG15（ISG15cKO）和野生型小鼠中建立肝纤维化。体外使用遗传策略，确立了ISG15在HSCs中的作用。免疫沉淀、荧光素酶报告基因测定和染色质免疫沉淀测定（ChIP）结合HSCs中的蛋白质组学测序用于研究相关的下游机制。结果：ISG15在激活的HSCs和纤维化肝脏中低表达，与肝纤维化患者中的α-平滑肌肌动蛋白呈负相关。ISG15cKO小鼠出现自发性肝纤维化，并表现出加剧的CCl4/BDL诱导的纤维生成。在体外，ISG15调节HSC活化、增殖和过量的细胞外基质产生。HSCs中ISG15缺失通过增强磷酸化的cAMP反应元件结合蛋白1（CREB1）活性来促进转化生长因子β2（TGFβ2）的转录，从而诱导CREB1结合TGFβ2启动子区域以激活TGFβ2/SMAD2信号传导。ISG化修饰直接在Lys-304和Lys-305上结合CREB1以抑制p-CREB1活性。HSCs中ISG15的过表达或666-15对CREB1的药理学抑制可消除CCl4处理小鼠中ISG15缺失诱导的肝纤维化。结论：ISG15部分通过CREB1/TGFβ2/SMAD2调控通路调节HSC活化和肝纤维化。利用ISG15-CREB1信号可能是肝纤维化的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ISG15在肝星状细胞活化和肝纤维化中发挥什么作用？其潜在的分子机制是什么？
- 核心机制
- ISG15通过ISG化修饰直接结合CREB1的Lys-304和Lys-305，抑制p-CREB1活性及其核转位，从而减少CREB1与TGFβ2启动子的结合，抑制TGFβ2转录，进而抑制TGFβ2/SMAD2信号通路和HSC活化。
- 主要证据
- 基于人肝样本、小鼠模型（CCl4、BDL、MASH饮食、自发衰老）、LX-2细胞和原代HSC的研究表明，ISG15缺失导致CREB1活性增强、TGFβ2上调、HSC活化和纤维化加剧；ISG15过表达或CREB1抑制剂666-15可减轻纤维化。
- 研究意义
- 本研究揭示了ISG15-CREB1-TGFβ2轴作为新的促纤维化通路，并提出CREB1抑制作为肝纤维化的一种可转化的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
上游调控研究
探究ISG15在HSC中表达下调的机制。
检测干扰素通路分子表达，验证IFN-β对IRF9和ISG15表达的诱导作用，并通过IRF9敲低和荧光素酶报告实验证明IRF9调控ISG15转录。
体内功能缺失研究
验证HSC中ISG15缺失对肝纤维化的影响。
构建HSC特异性ISG15敲除小鼠，在不同年龄及CCl4、BDL、CDAHFD模型中评估肝纤维化程度。
体外功能研究
确定ISG15对HSC活化、增殖和ECM产生的作用。
在LX-2细胞和原代HSC中使用CRISPR/Cas9敲除ISG15、shRNA敲低UBE2L6或USP18、siRNA敲低ISG15、UBE2L6、USP18，检测活化标志物（αSMA）、ECM蛋白（Col1α1、纤连蛋白、波形蛋白）和增殖。
机制研究
探索ISG15调节TGFβ2表达的分子机制。
通过蛋白质组学、qPCR、Western blot、ELISA确认TGFβ2上调，并通过荧光素酶报告实验、ChIP、突变分析和蛋白-蛋白相互作用实验确定ISG15通过ISG化修饰CREB1调控其转录活性。
体内治疗验证
验证ISG15过表达或CREB1抑制剂对肝纤维化的保护作用。
通过AAV尾静脉注射在HSC中过表达ISG15，或用CREB1抑制剂666-15处理CCl4诱导的纤维化小鼠，评估肝纤维化程度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | CREB1抑制剂666-15 | -- | -- |
| 基因过表达 | AAV-GFAP-ISG15 | -- | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 抗体 | 抗αSMA抗体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | CCl4给药剂量、频率、周期；BDL手术时间；CDAHFD饮食时间；ISG15cKO小鼠的构建方法；AAV尾静脉注射的滴度和体积 阅读提示：Methods, Figure legends |
| 药物处理 | 666-15给药剂量（10 mg/kg）、频率（每周两次）、途径（腹腔注射）；给药开始时间 阅读提示：Figure 8B |
| 细胞培养与处理 | LX-2细胞培养条件；siRNA/shRNA转染剂量和时间；IFN-β处理浓度和时间；外源ISG15处理浓度（100 ng/mL） 阅读提示：Methods, Online supplemental materials |
| 分子检测 | ChIP实验所用抗体、细胞数量、固定条件；荧光素酶报告实验所用报告基因载体和共转染质粒；IP/质谱实验所用标签和细胞系 阅读提示：Methods, Figure legends |