单细胞转录组数据分析
鉴定cSCC角质形成细胞亚群中特异性表达的lncRNA
对已发表的正常和cSCC皮肤组织单细胞RNA-seq数据重新比对，使用FANTOM CAT注释进行伪bulk分析，比较正常和肿瘤中的角质形成细胞亚群（基底、周期、分化）及TSK亚群，筛选差异表达lncRNA。
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体内CRISPR干扰筛选揭示对皮肤鳞状细胞癌肿瘤生长至关重要的长链非编码RNA谱系
In Vivo CRISPR Interference Screen Reveals Long Noncoding RNA Portfolio Crucial for Cutaneous Squamous Cell Carcinoma Tumor Growth
实验完整度
高包含体外CRISPRi筛选、体内异种移植模型筛选、ASO敲低功能验证、RNA-seq机制分析及临床样本smRNA-FISH验证等多个独立证据层级。
主要模型
A431人皮肤鳞状细胞癌细胞系 Cal27人口腔鳞状细胞癌细胞系 人原代角质形成细胞 SCID无毛小鼠异种移植瘤模型
重点核对
CRISPRi文库的sgRNA设计区域为TSS上下游-200至+450核苷酸 体外筛选在A431和Cal27细胞系中进行，原代角质形成细胞筛选1.5周，癌细胞系筛选3周 体内筛选使用SCID无毛小鼠，每细胞系3只小鼠，每只小鼠6个肿瘤，注射4×10^6细胞与Matrigel混合 ASO敲低使用20 nM浓度，转染48小时 TCGA生存分析校正了性别偏倚
摘要
皮肤鳞状细胞癌（cSCC）占全球所有皮肤癌死亡率的20%，是第二高发的皮肤癌亚型。cSCC在人类中的高患病率凸显了揭示影响皮肤癌发展的其他因素和机制的必要性。尽管在理解cSCC生长的一些关键因素方面已取得重大进展，但关于非编码RNA，特别是长链非编码RNA（lncRNA）这一特定亚类的作用知之甚少。通过对正常和cSCC人类皮肤组织的单细胞测序数据进行伪bulk分析，我们确定了角质形成细胞亚群中特异性表达的lncRNA的全局谱系。体外CRISPR干扰筛选与异种移植模型的整合，鉴定了数个在体外和体内影响cSCC癌细胞系生长的lncRNA。其中，我们进一步验证了LINC00704和LINC01116作为cSCC细胞系中调节增殖的lncRNA，并作为cSCC生长的潜在生物标志物。总之，我们的研究提供了在调节cSCC生长中具有作用的lncRNA的综合特征。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 皮肤鳞状细胞癌中哪些长链非编码RNA在角质形成细胞亚群中特异性表达并调控肿瘤生长？
- 核心机制
- LINC00704和LINC01116通过调节细胞增殖和存活来影响cSCC生长，并在角质形成细胞分化状态的调控中发挥拮抗作用。
- 主要证据
- 基于单细胞测序伪bulk分析鉴定294个lncRNA，体外CRISPRi筛选和体内异种移植模型共同鉴定7个lncRNA，其中LINC00704和LINC01116经ASO敲低验证影响细胞活力、细胞周期、克隆形成和细胞死亡，RNA-seq分析揭示共同和分歧的基因表达变化。
- 研究意义
- 研究提供了lncRNA在cSCC生长中的综合特征，LINC00704可能作为cSCC生长的生物标志物，并为靶向特定角质形成细胞亚群的未来治疗策略提供新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
功能性lncRNA筛选
筛选具有潜在功能的cSCC相关lncRNA
利用FANTOM CAT数据库的注释信息，筛选具有至少两个功能特征的lncRNA。
体外CRISPRi筛选
在2D培养条件下鉴定影响cSCC增殖的lncRNA
构建靶向176个lncRNA启动子的CRISPRi文库（每个靶点10个sgRNA），在A431、Cal27和原代角质形成细胞中进行筛选，通过MAGeCK-MLE分析β-score。
体内CRISPRi筛选
在体内异种移植模型中验证lncRNA对肿瘤生长的影响
将靶向176个启动子的sublibrary感染A431和Cal27细胞，皮下注射至SCID无毛小鼠，3-4周后收获肿瘤，提取DNA测序，整合in vitro和in vivo数据。
候选lncRNA功能验证
验证LINC00704和LINC01116对cSCC细胞增殖和存活的影响
设计ASO敲低LINC00704和LINC01116，在A431细胞中检测细胞活力、细胞周期、细胞死亡和克隆形成。
RNA-seq和机制分析
探究LINC00704和LINC01116敲低后的下游效应
对ASO敲低后的A431细胞进行bulk RNA-seq，鉴定共同和分歧的基因表达变化，并进行GSEA分析。
临床相关性分析
评估LINC00704和LINC01116表达与临床结果的相关性
利用TCGA数据（CESC、ESCA、BLCA、LUSC、HNSC）进行生存分析，并使用smRNA-FISH在人类正常和SCC皮肤组织中检测LINC00704表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取和qPCR | RNeasy Plus微型试剂盒 | QIAGEN | -- |
| NanoDrop ONE分光光度计 | Thermo Fisher | -- | |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| LightCycler 480 II系统 | Roche | -- | |
| SYBR Green预混液 | Thermo Fisher | -- | |
| Western blot | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| NUPAGE 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE凝胶 | Thermo Fisher | -- | |
| PVDF膜 | Promega | -- | |
| Intercept封闭缓冲液 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 抗flag抗体 | CST | -- | |
| 山羊抗兔二抗 | LI-COR Biosciences | -- | |
| Odyssey CLx红外成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| Licor ImageStudioLite软件 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 慢病毒生产 | 脂质体转染试剂 | -- | -- |
| Lenti-X浓缩器 | Takara | -- | |
| pLentiguide载体 | -- | -- | |
| 文库构建 | NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒 | -- | -- |
| Stellar感受态细胞 | -- | -- | |
| Plasmid Plus Maxi试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| MiSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| 体外CRISPRi筛选 | DNeasy血液和组织试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 体内CRISPRi筛选 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| MP Biomedical裂解基质A管 | MP Biomedical | -- | |
| SCC球体模型 | 聚甲基丙烯酸羟乙酯 | Sigma | -- |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Worthington | -- | |
| 胶原酶I | Gibco | -- | |
| 细胞筛网 | Corning | -- | |
| 10x Chromium系统 | 10x Genomics | -- | |
| Chromium GEM-X单细胞3'试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| ASO转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| LRT plus裂解缓冲液 | Qiagen | -- | |
| RNeasy微型试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-blue试剂 | Promega | -- |
| SpectraMax M5酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 细胞周期和凋亡分析 | Zombie NIR染料 | BioLegend | -- |
| Alexa-Fluor-488偶联大鼠抗Ki-67抗体 | Thermo Fisher | -- | |
| 核糖核酸酶A | Qiagen | -- | |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 细胞死亡分析 | FITC标记的Annexin V | BD Pharmingen | 556547 |
| Attune流式细胞仪 | Thermo Fisher | -- | |
| 克隆形成实验 | 结晶紫 | Sigma | HT90132 |
| 乙酸 | Fisher Chemical | A38S | |
| RNA-seq | QuantSeq 3' mRNA-Seq V2文库制备试剂盒FWD with UDI | Lexogen | -- |
| NovaSeq X+测序仪 | Illumina | -- | |
| smRNA-FISH | RNAScope多重荧光试剂盒v2 | Advanced Cell Diagnostics | -- |
| Hs-LINC00704-C1探针 | Advanced Cell Diagnostics | 411081-C1 | |
| Hs-Malat1-C2探针 | Advanced Cell Diagnostics | 400811-C2 | |
| Opal 570试剂 | Perkin Elmer | -- | |
| Opal 650试剂 | Perkin Elmer | -- | |
| Duolink封片剂 | Sigma | -- | |
| Zeiss LSM 780共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| ImageJ软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞数据分析 | 数据集来源、比对软件和注释数据库、差异表达分析的阈值 阅读提示：Materials and Methods - Pseudobulk analysis of human skin tissue single-cell RNA-seq data |
| 体外CRISPRi筛选 | 细胞系、文库构建、转染条件、筛选时间、β-score阈值 阅读提示：Materials and Methods - In-vitro CRISPRi screen |
| 体内CRISPRi筛选 | 小鼠品系、注射细胞数、肿瘤生长时间、肿瘤DNA提取和测序条件 阅读提示：Materials and Methods - In-vivo CRISPRi screen |
| ASO敲低功能验证 | ASO序列、转染浓度和时间、检测方法 阅读提示：Materials and Methods - ASO design and efficiency test; CellTiter-blue viability assay; Cell cycle and cell death analysis; Colony formation assay |
| RNA-seq | 文库制备试剂盒、测序平台和参数、差异表达分析流程 阅读提示：Materials and Methods - Bulk RNA-sequencing and Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) |
| 生存分析 | TCGA数据选择、校正因素、统计方法 阅读提示：Materials and Methods - TCGA survival analysis |
| smRNA-FISH | 组织来源、探针、可视化试剂、成像和定量方法 阅读提示：Materials and Methods - smRNA-FISH |