样本收集与 PBMC 分离
获取健康、OA 和 DMT 患者的外周血单个核细胞，用于免疫表型分析。
从健康供者、OA 患者和 DMT 患者收集全血，通过 Ficoll 密度梯度离心分离 PBMC，并冷冻保存。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
循环免疫细胞的多参数分析鉴定出骨关节炎中 CD25high 类别转换记忆 B 细胞的扩增
Multiparametric Profiling of Circulating Immune Cells Identifies an Expansion of CD25high Switched Memory B Cells in Osteoarthritis
实验完整度
高包含多层级验证：cyTOF 免疫表型分析、单细胞 RNA 测序、独立验证队列、DMT 高风险人群对比分析，并进行了功能通路富集分析。
主要模型
外周血单个核细胞（PBMC） B 细胞富集后的 PBMC 早期及中度 OA 患者样本 退行性半月板撕裂（DMT）患者样本
重点核对
OA 患者（n=17）和健康对照（n=21）的 PBMC cyTOF 使用 29 标记抗体面板进行免疫分型 单细胞 RNA 测序验证 B 细胞亚群 独立验证队列（5 例 OA，6 例健康） DMT 患者（n=10）作为 OA 风险人群
摘要
目的：骨关节炎（OA）是一种慢性、致残性疾病，目前尚无改善病情的药物。迄今为止，OA 患者的生物标志物鉴定仅限于血清蛋白和批量表观基因组特征鉴定。方法：通过飞行时间质谱流式细胞术（cyTOF），使用 29 标记面板对来自 21 名健康供者、17 名 OA 患者和 10 名退行性半月板撕裂（DMT）患者的外周血单个核细胞（PBMC）进行单细胞分辨率的免疫表型分析，以识别循环免疫细胞中与 OA 相关的特征。利用单细胞 RNA 测序来揭示 OA 中受扰动的免疫细胞群的功能机制。结果：健康供者与 OA 患者 PBMC 的比较揭示了 OA 中明显的扰动。虽然初始 B 细胞亚群减少，但类别转换记忆 B 细胞在 OA 中显著扩增，包括一个 CD25hiCXCR5hiCD27+IgD- 亚群。单细胞 RNA 测序揭示了 OA 中 CD25hi 类别转换记忆 B 细胞的 IL2/Stat3 和 TNF 信号传导功能障碍。在 DMT 患者（OA 风险增高人群）中也观察到类似的 CD25hi 类别转换记忆 B 细胞扩增。结论：CD25hi 类别转换记忆 B 细胞群体被确定为 OA 的潜在细胞生物标志物，可在易于获取的循环血细胞的 OA 早期阶段检测到。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 骨关节炎患者外周血循环免疫细胞中的免疫细胞亚群是否与健康人不同，以及这些差异是否可作为 OA 的早期生物标志物？
- 核心机制
- CD25hi 类别转换记忆 B 细胞中 IL2/STAT5 和 TNFα（通过 NFκB）信号通路功能失调，可能参与 OA 发病机制。
- 主要证据
- cyTOF 显示 OA 中 CD25hi 类别转换记忆 B 细胞亚群（CD25hiCXCR5hiCD27+IgD-）扩增，scRNA-seq 验证了该亚群的扩增及 IL2/STAT5、TNFα 和 TGFβ 信号通路富集。
- 研究意义
- CD25hi 类别转换记忆 B 细胞可能作为 OA 的潜在细胞生物标志物，有助于早期检测和患者分层，为精准医学方法提供支持。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
质谱流式细胞术免疫分型
识别 OA 与健康对照之间的免疫细胞亚群差异。
使用 29 标记抗体面板对 PBMC 进行染色，进行质谱流式细胞术（cyTOF）分析，并进行手动门控或 FlowSOM 聚类。
单细胞 RNA 测序验证
验证 cyTOF 结果，并揭示 OA 中扩增的 B 细胞亚群的转录组特征。
从 OA 和健康样本中分离 B 细胞，进行单细胞 RNA 测序，并使用 Seurat 分析聚类和差异表达。
独立验证队列验证
在独立的患者队列中验证 CD25hi 类别转换记忆 B 细胞扩增的发现。
对新收集的 OA 和健康对照 PBMC 进行 cyTOF 分析，并检查 B 细胞亚群的变化。
DMT 高风险人群免疫图谱分析
评估 OA 风险人群（DMT）中是否出现类似 OA 的免疫特征。
对 DMT 患者的 PBMC 进行 cyTOF 分析，并与 OA 和健康对照比较 B 细胞和 CD4T 细胞亚群频率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
免疫细胞表型分析
单细胞转录组分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| PBMC 分离 | Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | -- |
| ACK 裂解缓冲液 | Gibco | -- | |
| 细胞冻存 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
| 质谱流式染色 | 顺铂 | -- | -- |
| Maxpar 人免疫监测面板试剂盒 | Fluidigm | 210324 | |
| Cell-ID 20 重条形码试剂盒 | Fluidigm | -- | |
| Cell-ID 嵌入剂 | Fluidigm | -- | |
| EQ 四元素校准微球 | Fluidigm | -- | |
| 质谱流式检测 | CyTOF2 质谱流式细胞仪 | Fluidigm | -- |
| B 细胞分选 | 人泛 B 细胞分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-101-638 |
| 单细胞 RNA 测序 | Evercode WT Mini v1 试剂盒 | Parse Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PBMC 分离 | Ficoll 密度梯度离心参数（200g 10 分钟、1000g 15 分钟），ACK 裂解缓冲液处理，冷冻保存条件（FBS+20% DMSO） 阅读提示：在 Materials and Methods 的 'Peripheral blood collection and PBMC isolation' 部分 |
| 质谱流式细胞术 | 29 标记抗体面板，顺铂染色浓度（10μM）和时间（5 分钟），条形码试剂盒，CyTOF2 仪器，批次效应校正方法 阅读提示：在 Materials and Methods 的 'PBMC staining and mass cytometry' 部分 |
| 单细胞 RNA 测序 | B 细胞分离试剂盒（Human Pan B cell isolation kit），文库制备试剂盒（Evercode WT Mini v1），测序平台和分析流程（过滤条件：>5000 特征和 >20000 转录本，线粒体读段 <15%） 阅读提示：在 Materials and Methods 的 'B cell isolation' 和 'Single cell (sc) RNA library preparation, sequencing and analyses' 部分 |
| 验证队列 | 验证队列的样本量（5 例 OA，6 例健康），患者纳入标准 阅读提示：在 Materials and Methods 的 'Validation cohort' 部分和 Figure S7 相关描述 |