污水监测EV-D68 RNA
持续检测污水中EV-D68 RNA浓度，以追踪社区病毒循环。
每周从两座污水处理厂采集未处理进水污水500 mL，使用EPISENS-M方法进行病毒RNA提取和RT-PCR定量，并用PMMoV作为内参归一化。
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前瞻性利用污水监测在儿童社区疫情中早期检测肠道病毒D68，日本新潟市，2024年
Prospective use of wastewater surveillance for early detection of enterovirus D68 in community outbreaks among children, Niigata City, Japan, 2024
实验完整度
中前瞻性污水监测与临床监测结合，包含病毒RNA定量、相关性分析、系统发育分析等，但缺乏功能验证或机制验证，且临床采样仅在部分患者进行。
主要模型
新潟市两座污水处理厂（WWTP-1和WWTP-2）的未处理进水污水 新潟市六家医院收治的喘息儿童（≤15岁）
重点核对
污水样本：每周采集，来自两座污水处理厂，共93份（WWTP-1 45份，WWTP-2 48份） EV-D68检测方法：EPISENS-M方法，检出限为1 copy/μL RNA（对应6.7×10² copies/L污水），用PMMoV归一化 临床病例定义：儿童（≤15岁）喘息，且诊断为哮喘样呼吸道疾病或哮喘加重 鼻咽拭子采集时间：2024年第37-52周，仅从31/78名住院喘息儿童中采集 统计分析：Spearman秩相关检验，p<0.05为显著
摘要
引言：肠道病毒D68（EV-D68）是一种可导致儿童急性呼吸道疾病且难以预测疫情的再现病原体。目的：为了预测儿童疫情，我们调查了污水监测能否及时检测到日本新潟市EV-D68及其亚型的循环。方法：2024年1月至12月，每周采集一次污水样本，测定EV-D68 RNA浓度。监测新潟市六家设有儿科病床的医院因喘息入院的儿童（≤15岁）数量；2024年9月至12月，对部分儿童进行鼻咽拭子EV-D68检测。对来自患者和污水样本的EV-D68核苷酸序列进行系统发育分析。结果：2024年1月至12月，在93份污水样本中，39份（41.9%）检出EV-D68 RNA。首次检出EV-D68发生在第27周，随后RNA浓度升高。从第32周开始，因喘息入院的儿童数量增加，在第37周达到高峰。截至第52周，六家医院共收治195名喘息儿童。污水中EV-D68 RNA浓度与儿童喘息入院人数呈正相关（ρ=0.54, p<0.001）。在第37-52周，31名住院儿童中16名（10女/6男；中位年龄4.8岁；四分位距3.1-7.5）经检测为EV-D68阳性。感染他们的毒株仅属于B3亚型，而污水中的毒株属于D1和B3亚型。结论：污水监测及时检测到EV-D68活动的增加，揭示了患者中未检测到的亚型循环。因此，它可能支持EV-D68疫情的预测和应对，并可能扩展到其他病原体。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 污水监测能否及时检测到儿童EV-D68疫情并提供亚型信息？
- 核心机制
- 污水EV-D68 RNA浓度上升早于儿童喘息住院增加，两者呈正相关；患者中仅检出B3亚型，而污水中同时存在B3和D1亚型，提示D1亚型可能在社区（可能主要在成人）中循环。
- 主要证据
- 2024年1-12月，39/93份污水样本EV-D68阳性，首次检出在第27周，浓度第39周达峰；同期六家医院195名喘息儿童住院，第37周达峰；相关性ρ=0.54, p<0.001；16/31名住院儿童EV-D68阳性（B3亚型），污水样本中检出B3和D1亚型。
- 研究意义
- 污水中EV-D68 RNA检出可提前约5周预警儿童喘息住院增加，可用于支持EV-D68疫情预测和应对，并有望扩展到其他病原体。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
临床监测儿童喘息住院
记录因喘息住院的儿童数量，以评估临床疾病负担。
回顾性收集2024年全年六家医院因喘息住院的儿童（≤15岁）每周数据，并前瞻性收集第37-52周部分患者的临床信息和鼻咽拭子。
患者EV-D68检测
确定住院喘息儿童中EV-D68感染的频率和亚型。
对鼻咽拭子样本进行RNA提取，使用实时PCR和半巢氏PCR检测EV-D68，并对阳性样本进行VP1区域测序。
序列分析和分型
确定污水和临床样本中EV-D68的亚型，并比较两者差异。
对污水和临床样本中EV-D68 VP1区域进行测序，通过系统发育分析确定亚型，并与GenBank参考序列比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
临床样本病毒检测
统计分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 污水样本采集 | 无菌塑料瓶 | -- | -- |
| 污水病毒浓缩 | 电负性膜（90 mm直径；0.8 μm孔径；Merck Millipore） | Merck Millipore | -- |
| RNA提取 | PowerWater研磨管（RNeasy PowerWater Kit；Qiagen） | Qiagen | -- |
| QIAcube Connect平台 | Qiagen | -- | |
| RNeasy PowerMicrobiome试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 逆转录预扩增 | iScript Explore一步法RT预扩增试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| 实时PCR | iQ Supermix | Bio-Rad Laboratories | -- |
| 一步法PrimeScript RT-PCR（TaKaRa） | Takara | -- | |
| Thermal Cycler Dice实时荧光定量PCR仪III | Takara | -- | |
| 标准曲线 | EV-D68和PMMoV的gBlocks基因片段 | Integrated DNA Technologies | -- |
| RNA提取（临床样本） | QIAamp MinElute病毒RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | SuperScript VILO MasterMix逆转录试剂 | Invitrogen | -- |
| 克隆 | TOPO克隆（Thermo Fisher Scientific） | Thermo Fisher Scientific | -- |
| PCR产物纯化 | NucleoSpin凝胶和PCR产物纯化试剂盒 | Takara | -- |
| 呼吸道病原体检测 | FilmArray呼吸道病原体检测组合 | BioFire Diagnostics, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 污水样本采集 | 采样频率：每周一次；采样地点：两座污水处理厂（WWTP-1和WWTP-2）的进水口；采样时间：2024年第2-52周（WWTP-1）和第5-52周（WWTP-2）；样本类型：未处理进水污水；样本量：500 mL 阅读提示：Methods中的Wastewater data小节 |
| 污水病毒RNA检测 | 检测方法：EPISENS-M方法；RNA提取：使用PowerWater bead beating tube和RNeasy PowerWater Kit；RT-Preamp使用iScript Explore One-Step RT PreAmp Kit；实时PCR使用iQ Supermix；检出限：1 copy/μL RNA；归一化：PMMoV 阅读提示：Methods中的Detection of EV-D68 RNA in wastewater samples小节 |
| 临床监测 | 病例定义：儿童（≤15岁）喘息且诊断为哮喘样呼吸道疾病或哮喘加重；监测医院：六家；监测时段：2024年全年；鼻咽拭子采集：第37-52周，仅对住院儿童且获得知情同意者 阅读提示：Methods中的Clinical data小节 |
| 临床样本检测 | 检测方法：实时PCR和半巢氏PCR；RNA提取：QIAamp MinElute Virus Spin Kit；检测时间：第37-52周 阅读提示：Methods中的EV-D68 detection in clinical specimens小节 |
| 序列分析和分型 | 测序区域：部分VP1；测序方法：Sanger测序；克隆：必要时TOPO克隆；系统发育分析：最大似然法，MEGA6，1000 bootstrap 阅读提示：Methods中的Sequencing and phylogenetic analysis小节 |
| 统计分析 | 相关性分析：Spearman秩相关检验，p<0.05为显著；统计软件：R版本4.4.1 阅读提示：Methods中的Statistical analysis小节 |