单细胞转录组图谱构建与LRRC15+ CAF鉴定
鉴定肺癌中肿瘤富集且与不良预后相关的成纤维细胞亚群。
整合12个scRNA-seq数据集（145例供者，26091个基质细胞），通过无监督聚类鉴定出13个基质细胞簇，并将成纤维细胞分为9个亚群，其中LRRC15+ CAF（fibro-LRRC15, c03）为肿瘤富集的肌成纤维细胞亚群。
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靶向癌症相关成纤维细胞中的LRRC15可修饰细胞外基质并增强肿瘤免疫应答，从而抑制肺癌进展
Targeting LRRC15 in Cancer-Associated Fibroblasts Modifies the Extracellular Matrix and Enhances Tumor Immune Responses to Suppress Lung Cancer Progression
实验完整度
高包含单细胞转录组学分析、体外共培养、CRISPR敲除、多种小鼠肿瘤模型（皮下、转移及自发模型）及双特异性抗体治疗验证，涵盖功能验证和机制验证。
主要模型
TC1-GFP和LLC细胞与CAF共注射的C57BL/6J小鼠皮下肿瘤模型 KPS细胞（源自KrasLSL-G12D; p53fl/fl; Sftpc-iCre小鼠的自发肺肿瘤）皮下移植模型 LLC-Luc细胞尾静脉注射的肺转移模型 人PBMC来源的单核细胞分化巨噬细胞（mo-MΦ）与人肺癌CAF共培养体系
重点核对
验证LRRC15在CAF中的特异性表达及在正常组织中的低表达 验证LRRC15缺失对肿瘤生长的抑制作用依赖于免疫系统 验证LRRC15缺失通过减少ECM产生（尤其是胶原蛋白I）抑制CD206+巨噬细胞极化 验证LRRC15-TGFβ双特异性抗体的体内靶向性和抗肿瘤效果
摘要
癌症相关成纤维细胞（CAF）在塑造肿瘤微环境和驱动肿瘤进展中发挥着至关重要的作用。尽管单细胞转录组学已揭示CAF的表型和功能异质性，但针对CAF的有效治疗策略仍然迫切需求。在本研究中，我们确定了LRRC15+ CAF是肺癌中肿瘤特异性的CAF亚群，并提出LRRC15是一个潜在的治疗靶点。LRRC15缺失通过调节巨噬细胞极化和增强CD8+ T细胞活化来抑制小鼠肺癌进展。机制上，LRRC15缺失通过减少CAF中细胞外基质（ECM）的产生来抑制CD206+巨噬细胞极化，导致CD8+ T细胞细胞毒性增加。最后，开发了一种靶向LRRC15和TGFβ的双特异性抗体，能有效下调CAF中LRRC15的表达并限制小鼠肿瘤进展。本研究突出了LRRC15作为有前景的治疗靶点，并为CAF导向的癌症治疗策略提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LRRC15+ CAF在肺癌中发挥促肿瘤作用的机制及其作为治疗靶点的潜力。
- 核心机制
- LRRC15通过促进CAF产生细胞外基质（尤其是胶原蛋白I），诱导CD206+巨噬细胞（M2型）极化，进而抑制CD8+ T细胞的细胞毒性，从而促进肺癌进展。
- 主要证据
- 通过scRNA-seq和mIHC证实LRRC15+ CAF在肿瘤中富集并与不良预后相关；通过多种小鼠模型（TC1/LLC共注射、KPS皮下、LLC-Luc转移）证明LRRC15缺失抑制肿瘤生长且依赖免疫；通过共培养和ECM实验证明LRRC15缺失减少胶原产生并降低M2极化；双特异性抗体治疗降低LRRC15表达并抑制肿瘤。
- 研究意义
- LRRC15是CAF功能的关键调控因子，并代表一个有前景的治疗靶点，为肺癌的CAF导向免疫治疗策略提供了见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LRRC15作为潜在治疗靶点的筛选与验证
筛选在LRRC15+ CAF中高表达且在正常组织中低表达的膜蛋白，评估其作为治疗靶点的可行性。
通过差异表达分析和组织特异性分析，筛选在LRRC15+ CAF中高表达且在肿瘤中富集的膜蛋白，并通过GTEx数据、GEPIA和流式细胞术验证LRRC15的特异性。
体外CAF诱导模型建立和CRISPR敲除
建立TGF-β诱导的LRRC15+ CAF样细胞模型，并敲除LRRC15以研究功能。
用TGF-β处理小鼠肺成纤维细胞和人肺成纤维细胞3天，诱导LRRC15表达；通过CRISPR-Cas9敲除小鼠和人的LRRC15，并验证敲除效率。
多种小鼠肿瘤模型验证LRRC15缺失的抗肿瘤作用
验证LRRC15缺失对肿瘤生长的影响，并确定是否依赖免疫系统。
建立肿瘤细胞与CAF共注射模型（TC1-GFP、LLC）、KPS皮下模型和LLC-Luc肺转移模型，比较WT与Lrrc15-KO或条件敲除小鼠的肿瘤生长；在NSG免疫缺陷小鼠中重复共注射模型。
肿瘤微环境中免疫细胞分析
评估LRRC15缺失对肿瘤浸润免疫细胞的影响。
通过多色流式细胞术分析肿瘤中淋巴细胞和髓系细胞亚群，并利用mIHC验证CD8+ T细胞和巨噬细胞的浸润变化。
体外共培养验证LRRC15在巨噬细胞极化中的作用
验证LRRC15缺陷CAF对巨噬细胞M2极化的影响。
将BMDMs或人mo-MΦ与WT或LRRC15-KO CAF共培养，检测CD206+巨噬细胞的比例和数量；通过Transwell和ECM共培养实验区分可溶性因子和直接接触的作用。
机制研究：LRRC15调节ECM产生并影响巨噬细胞极化
阐明LRRC15促进M2极化的机制是否通过ECM产生（尤其是胶原蛋白I）实现。
通过bulk RNA-seq比较WT和LRRC15-KO CAF的转录组，富集ECM通路；通过Sirius Red染色和Western blot检测胶原蛋白产生；在ECM上培养巨噬细胞检测CD206表达。
双特异性抗体开发与体内验证
开发靶向LRRC15和TGFβ的双特异性抗体，评估其抗肿瘤效果和安全性。
设计LRRC15-TGFβ-trap双特异性抗体，在KPS皮下模型中评估抗肿瘤效果，用AF555标记抗体检测肿瘤内靶向性，并检测LRRC15表达和ECM密度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965-092 |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875-093 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10091148 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | -- | -- | |
| 细胞处理 | 重组人TGFβ1 | R&D Systems | 7754-BH-005 |
| 重组小鼠TGFβ1 | R&D Systems | 7666-MB-005 | |
| 博来霉素 | -- | -- | |
| 抗体 | 抗LRRC15抗体（克隆#huM25） | AbbVie | -- |
| 抗LRRC15抗体（克隆#Abio-1） | Analytical Biosciences | -- | |
| LRRC15-TGFβ-trap双特异性抗体 | Jiangsu Hoekbio Biotech | -- | |
| 抗小鼠IL13抗体 | BioLegend | 522903 | |
| 抗小鼠IL4抗体 | BioLegend | 504121 | |
| 抗小鼠IL10抗体 | BioLegend | 504907 | |
| 抗小鼠TGFβRII抗体 | Jiangsu Hoekbio Biotech | -- | |
| 蛋白质检测 | 抗COL1A1抗体 | Cell Signaling Technology | 72026 |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| HRP标记的二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | 34577 | |
| IP裂解液 | Thermo Fisher Scientific | 87787 | |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Beyotime | P1045 | |
| 增强型BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010 | |
| RNA提取和qPCR | RNAprep Pure Micro总RNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP420 |
| HiScript III反转录预混液 | Vazyme | R323-01 | |
| ChamQ SYBR qPCR预混液（Low ROX预混） | Vazyme | Q331-02 | |
| 组织染色 | 改良天狼星红染色试剂盒 | Solarbio | G1472 |
| 胶原定量 | 可溶性胶原检测试剂盒 | Cell Biolabs | MET-5016 |
| 免疫组化 | PanoPANEL试剂盒 | Panovue | 10234100100 |
| 细胞分离 | 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-929/130-096-730 |
| CD14微珠 | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| EasySep小鼠CD8+ T细胞分选试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19853 | |
| 人CD8+ T细胞分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-495 | |
| 流式细胞术 | Foxp3/转录因子染色缓冲液 | eBioscience | 00-5523 |
| Dynabeads小鼠T细胞活化磁珠CD3/CD28 | Gibco | 11453D | |
| 细胞因子 | 重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子 | Gibco | 315-02 |
| 重组人巨噬细胞集落刺激因子 | Gibco | 300-25 | |
| 白细胞介素-2 | PeproTech | 200-02 | |
| 人T细胞活化剂 | Miltenyi Biotec | 130-111-160 | |
| 人I型胶原蛋白 | MedChemExpress | HY-NP160 | |
| 荧光标记 | Alexa Fluor 555 NHS酯 | Thermo Fisher Scientific | A37571 |
| Zeba染料和生物素去除离心柱 | Thermo Fisher Scientific | A44296 | |
| 细胞培养耗材 | Transwell插入式培养皿（0.4 μm） | Corning | 07-200-165 |
| 微生物检测 | MycoBlue支原体检测试剂 | Vazyme | D101-02 |
| RNA-seq建库 | Equalbit RNA高灵敏度检测试剂盒 | Vazyme | EQ211-02 |
| TruePrep RNA文库制备试剂盒（Illumina） | Vazyme | TR501-TR503 | |
| 设备 | FACSymphony A5 SE流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| SLIDEVIEW VS200扫描仪 | Olympus | -- | |
| IVIS Lumina XRMS系列III活体成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| Qubit 2.0荧光计 | Invitrogen | -- | |
| 测序平台 | NovaSeq 6000测序仪 | Novogene | -- |
| 软件 | FlowJo 10.8.1软件 | FlowJo | -- |
| OlyVIA软件（版本3.3） | Olympus | -- | |
| HALO 3.3软件 | Indica Labs | -- | |
| ImageJ软件 | -- | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件版本9.3.1 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠品系（C57BL/6J、NSG、Lrrc15-KO、Col1a2-CreER; Lrrc15fl/fl等）；肿瘤细胞系（TC1-GFP、LLC、KPS、LLC-Luc）及接种数量；注射方式（皮下、尾静脉）；肿瘤体积测量时间和公式 阅读提示：Methods: Mouse tumor models |
| CAF诱导与培养 | TGF-β浓度（10 ng/mL）和处理时间（3天）；基础培养基（DMEM/F12或DMEM）；FBS浓度（10%）；低氧培养条件；酶消化液组成及时间 阅读提示：Methods: Primary fibroblast isolation and culture |
| CRISPR敲除 | sgRNA序列（人LRRC15 sgRNA-1/2，小鼠Lrrc15 sgRNA-1/2，对照sgRNA）；载体（LentiCRISPRv2GFP，LentiGuide）；转染/感染方法 阅读提示：Methods: CRISPR KO |
| 共培养实验 | 细胞比例（CAF:巨噬细胞为1:1，CAF:T细胞为1:10）；共培养时间（2天）；细胞密度（1×10^5等）；Transwell孔径（0.4 μm）；细胞因子浓度（IL2 200 U/mL，阻断抗体浓度等） 阅读提示：Methods: Coculture of CAFs and macrophages; CAF and CD8+ T-cell coculture; Coculture of ECM of CAFs and macrophages |
| 抗体处理 | 双特异性抗体剂量（200 μg）和给药方案（腹腔注射，从第8天开始，每2天一次）；对照抗体（ISO-hIgG1）；体内成像标记（AF555） 阅读提示：Methods: LRRC15 antibodies; Mouse tumor models |
| 流式细胞术 | 抗体克隆和稀释度；染色缓冲液；消化方法；仪器型号；分析软件版本 阅读提示：Methods: Flow cytometry |
| 关键试剂 | 胶原蛋白检测试剂盒（Soluble Collagen Assay Kit）；天狼星红染色试剂盒；TGF-β重组蛋白；M-CSF；CD8+ T细胞分选试剂盒等 阅读提示：Methods: Collagen concentration assay; Sirius Red staining; Cell culture; Coculture assays |