血清TGFBI水平与预后的关联分析
评估血清TGFBI水平在癌症患者中的诊断和预后价值
通过ELISA检测CRC（n=54）、HCC（n=62）和健康供者（n=20）血清TGFBI浓度，并分析HCC患者（n=31）生存数据（Kaplan-Meier曲线）。
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转化生长因子β诱导蛋白作为一种新型分泌型免疫检查点，反向抑制人类肿瘤相关T细胞
Transforming growth factor β induced as a novel secreted immune checkpoint counterinhibiting human tumor-associated T cells
实验完整度
高包含患者样本分析（血清ELISA、组织IF、TMA）、体外细胞功能实验（TGFBI中和）、类器官共培养杀伤实验等多个独立证据层级，并包含机制验证。
主要模型
结直肠癌患者外周血和肿瘤组织来源的T细胞 肝细胞癌患者外周血和肿瘤组织来源的T细胞 结直肠癌患者来源类器官与自体PBMC共培养模型
重点核对
TGFBI中和抗体的浓度（3 μg/mL用于PBMC，0.3-3.0 μg/mL用于IHL，10 μg/mL用于类器官） 刺激条件：抗CD3/CD28 beads（1:5细胞比例用于PBMC，1:8用于纯化T细胞） 培养时间：PBMC和IHL为18小时或过夜，纯化T细胞为3天，类器官共培养为72小时 检测指标：流式细胞术检测CD25、CD69、IFN-γ、TNF-α、T-bet、颗粒酶B；LDH释放和ATP水平评估杀伤
摘要
背景：我们研究了转化生长因子β诱导蛋白（TGFBI），一种在多种肿瘤微环境中分泌的细胞外基质蛋白，是否可作为分泌型免疫检查点（sIC），参与抑制人类抗肿瘤T细胞反应。方法与结果：通过ELISA检测，结直肠癌（CRC）和肝细胞癌（HCC）患者的血清TGFBI浓度显著高于健康个体，并与较差的总生存期相关。引人注目的是，多参数流式细胞术分析显示，在癌症患者中，TGFBI由肿瘤细胞或单核细胞以及多种淋巴样细胞类型（包括CD4+或CD8+ T细胞（包括组织常驻记忆T细胞）、B细胞和自然杀伤细胞）高表达。重要的是，离体TGFBI中和显著增强了CD4+和CD8+ T细胞的活化和功能。新鲜分离的表达TGFBI的CD4+或CD8+ T细胞在TGFBI阻断后，表现出显著改善的分化为功能性效应细胞的能力，其特征是获得组织归巢表型。这些发现表明，TGFBI可以在T细胞内建立自分泌免疫抑制环，从而限制其分化和功能。这些机制观察结果进一步得到人类CRC类器官实验的支持，其中TGFBI阻断改善了主要组织相容性复合体I类限制性细胞毒性T细胞的扩增和肿瘤细胞杀伤。结论：综上所述，我们的数据表明，TGFBI作为一种sIC，反向调节T细胞的活化、分化和效应功能，而TGFBI阻断可恢复这些功能，对实体瘤的新型免疫治疗策略具有广泛意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TGFBI是否作为分泌型免疫检查点抑制人类肿瘤相关T细胞的功能和分化？
- 核心机制
- TGFBI通过自分泌环抑制T细胞活化、分化和效应功能，其机制涉及通过T细胞表面整合素触发抑制性信号，导致Lck抑制性酪氨酸Y505磷酸化。
- 主要证据
- 患者PBMC中TGFBI中和增强CD4+和CD8+ T细胞活化；纯化T细胞中TGFBI阻断促进向效应记忆表型分化；类器官共培养中TGFBI阻断增强MHC I类限制性CTL杀伤。
- 研究意义
- TGFBI阻断可能作为单一或联合治疗策略，用于对现有免疫检查点抑制剂耐药的冷肿瘤（如MSS CRC和HCC），并可能促进过继性细胞治疗的发展。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TGFBI在肿瘤组织中的表达定位
确定TGFBI在CRC和HCC肿瘤组织中的表达来源和分布
使用组织微阵列（TMA）和免疫荧光（IF）染色检测TGFBI表达，并与EpCAM、CD14、CD3、CD20共染。
TGFBI在免疫细胞亚群中的表达分析
确定TGFBI在癌症患者外周血和肿瘤浸润免疫细胞中的表达谱
通过流式细胞术分析PBMC、非肿瘤组织（NTUM）和肿瘤组织（TUM）中CD14+、CD4+、CD8+、CD20+、CD56+细胞的TGFBI表达，并检测分泌水平。
重组TGFBI对T细胞功能的抑制作用
验证外源性TGFBI是否抑制T细胞活化和分化
用重组TGFBI处理健康供者PBMC，通过流式细胞术检测T-bet、IFN-γ和颗粒酶B表达。
TGFBI中和对T细胞活化的影响（PBMC）
评估TGFBI阻断是否恢复癌症患者T细胞功能
CRC和HCC患者的PBMC在抗CD3/CD28刺激下，用中和抗TGFBI抗体（3 μg/mL）或同型对照处理，通过流式细胞术检测CD25和CD69表达。
TGFBI中和对肝内T细胞功能的影响
评估TGFBI阻断对肝脏常驻和浸润T细胞功能的影响
从HCC或CRC肝转移患者的非肿瘤肝组织分离肝内淋巴细胞（IHL），用抗CD3/CD28刺激，以不同浓度（0.3, 1.0, 3.0 μg/mL）抗TGFBI抗体处理，检测IFN-γ和TNF-α产生。
TGFBI中和对纯化T细胞分化的影响
证明TGFBI阻断在无其他细胞来源的情况下增强T细胞自身分化和效应功能
纯化的CD4+或CD8+ T细胞（来自3个健康供者）在抗CD3/CD28刺激下，用抗TGFBI抗体（20, 10, 5 μg/mL）或同型对照处理，通过流式细胞术检测CCR7和CD45RA表达以评估分化状态。
TGFBI中和对PDO共培养中T细胞杀伤的影响
在类器官模型中验证TGFBI阻断增强肿瘤特异性T细胞杀伤功能
CRC患者来源类器官（PDO）与自体PBMC共培养（E:T=20:1），加入抗TGFBI抗体（10 μg/mL）或对照，检测LDH释放和ATP水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ELISA检测 | Cusabio ELISA试剂盒 | Cusabio | -- |
| 细胞分离 | CD4+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-533 |
| CD8+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-495 | |
| CD8微珠 | Miltenyi Biotec | 130-045-201 | |
| TGFBI中和实验 | 抗TGFBI抗体（兔多克隆） | Proteintech Europe | 10188-1-AP |
| 兔同型对照IgG | Novus Biologicals Europe | NBP2-24893 | |
| 抗人TGFBI单克隆抗体18B3 | -- | -- | |
| 蛋白转运抑制剂混合物 | eBioscience, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PDO培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher | -- |
| II型胶原酶 | Thermo Fisher | -- | |
| 基质胶（生长因子减少的基底膜提取物） | Corning | -- | |
| PDO共培养 | II型分散酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| TrypLE Express酶 | Gibco | -- | |
| 抗人TGFBI中和抗体 | Proteintech Europe | 10188-1-AP | |
| 兔同型对照IgG | Novus Biologicals Europe | NBP2-24893 | |
| 抗人HLA-A、HLA-B、HLA-C抗体（克隆W6/32） | Biolegend | -- | |
| CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- | |
| LDH-Glo细胞毒性检测试剂盒 | Promega | -- | |
| IF检测 | CellEvent Caspase-3/7绿色检测试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| CellTracker Red CMPTX染料 | Invitrogen | -- | |
| Hoechst染料 | Invitrogen | -- | |
| Prolong-Gold防淬灭剂 | Thermo Fisher | -- | |
| 流式细胞术 | 可固定活力染料eFluor780 | eBiosciences | -- |
| BD Cytofix/Cytoperm固定/破膜试剂盒 | BD Biosciences | -- | |
| 可固定蓝色死活染料 | Thermo Fisher | L23105 | |
| LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| Cytek Aurora光谱流式细胞仪 | Cytek | -- | |
| FlowJo软件V.10.0.8r1 | TreeStar | -- | |
| IF染色 | Leica TCS-SP8X激光扫描共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| Axioscope 5显微镜 | KMAT, Zeiss | -- | |
| ZEN显微镜软件（蓝色版） | Zeiss | -- | |
| Zeiss LSM900共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| PDO共培养 | DTX-880多功能酶标仪 | Beckman Coulter | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本收集 | 患者来源（CRC和HCC）、样本类型（血清、PBMC、组织）、样本量、知情同意 阅读提示：Materials and methods: Study population |
| 细胞分离和培养 | PBMC和T细胞分离方法、培养基组分（RPMI 1640、FBS浓度、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、丙酮酸钠）、细胞密度 阅读提示：Materials and methods: Isolation of peripheral blood mononuclear cell subsets and TILs |
| TGFBI中和实验 | 中和抗体类型（兔多克隆或18B3）、浓度 (3 μg/mL或0.3-3.0 μg/mL)、刺激条件（抗CD3/CD28 beads）、培养时间 (18小时或3天) 阅读提示：Materials and methods: TGFBI neutralization in PBMCs and IHLs ex vivo, TGFBI neutralization in CD4+ and CD8+ isolated T cells |
| PDO共培养 | PDO来源、E:T比例（20:1）、细胞培养基（含BME和血清）、抗TGFBI浓度（10 μg/mL）、共培养时间（72小时） 阅读提示：Materials and methods: Patient-derived organoids, PBMC-PDO co-cultures |
| 流式细胞术 | 抗体克隆和荧光标记（详见补充表2）、门控策略、仪器（LSRFortessa或Cytek Aurora）、分析软件（FlowJo） 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry analysis, online supplemental figure 5 and figure 11A |