单核细胞和中性粒细胞在HSV-1感染角膜上皮层中的差异性归巢调节病毒播散和伤口愈合

Differential homing of monocytes and neutrophils in the epithelial layer of HSV-1 infected cornea regulates viral dissemination and wound healing

作者信息Mizumi Setia, Pratima Krishna Suvas, Mashidur Rana, Anish Chakraborty, Susmit Suvas
PMID39793926
期刊Ocul Surf
发布时间2025-04
DOI10.1016/j.jtos.2025.01.002

实验完整度

包含小鼠感染模型、角膜上皮与基质分离、流式细胞术动力学分析、MACS细胞去除/纯化及体外上皮划痕伤口愈合功能验证,具备多层级实验验证。

主要模型

C57BL/6J小鼠角膜HSV-1感染模型 HSV-1 McKrae、McKrae-GFP、RE感染角膜 hTCEpi人角膜上皮细胞系

重点核对

小鼠品系、年龄和性别:8-12周龄雌性C57BL/6J小鼠 角膜感染方法:右眼角膜表面轻度划伤(共12次),滴加3 μL病毒悬液(McKrae: 1×10^3 pfu/眼;McKrae GFP: 1×10^5 pfu/眼) 取材时间点:3、6、8、11、16天感染后(DPOI) MACS细胞去除/纯化:CD45微珠、CD11b微珠、Ly6G微珠(Miltenyi Biotec) 流式圈门策略:CD45+、CD11b+、Ly6ChiLy6G-(单核细胞)、Ly6CloLy6Ghi(中性粒细胞)

摘要

目的:确定HSV-1感染角膜在不同感染阶段上皮层与基质层中单核细胞和中性粒细胞的归巢情况,以及它们在病毒感染角膜中的解剖位置的功能意义。方法:用HSV-1 McKrae感染C57BL/6J小鼠角膜。在不同感染后天数处死小鼠。分离感染角膜的上皮层和基质层,进行流式细胞术以表征感染角膜上皮层与基质层中的髓系细胞亚群。使用MACS柱纯化中性粒细胞或去除感染角膜中的髓系细胞。进行角膜上皮划痕实验以确定中性粒细胞对上皮伤口愈合的影响。结果:我们的结果显示,在HSV-1感染角膜的上皮层而非基质层中,单核细胞呈双相涌入。此外,我们注意到在角膜HSV-1感染的临床前阶段,角膜上皮层和基质层中单核细胞均占优势。然而,在感染的临床疾病期,中性粒细胞是上皮层和基质层中的主要髓系细胞亚群。在临床前阶段,从感染上皮层中去除单核细胞促进病毒播散。有趣的是,角膜上皮层中的中性粒细胞抑制角膜上皮伤口愈合。结论:总之,我们的数据表明,单核细胞和中性粒细胞在上皮层的差异性归巢动力学调节HSV-1感染角膜中的病毒播散和上皮伤口愈合。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
HSV-1感染角膜中,单核细胞和中性粒细胞在上皮层与基质层的归巢动力学如何,以及它们在上皮层的定位对病毒播散和上皮伤口愈合有何功能影响?
核心机制
临床前期单核细胞在上皮层占优势,通过限制HSV-1诱导的角膜上皮细胞死亡和病毒向白细胞播散来控制病毒;临床期中性粒细胞在上皮层占优势,通过抑制角膜上皮细胞迁移从而阻碍上皮伤口愈合,可能导致坏死性HSK的持续性上皮缺损。
主要证据
流式细胞术分析显示单核细胞在3、6、8天感染后(DPOI)于上皮层呈双相涌入,中性粒细胞在11和16 DPOI占优势;CD45+细胞去除实验显示上皮细胞活性降低;CD11b+细胞去除实验显示GFP+白细胞频率和MFI增加;上皮中性粒细胞与hTCEpi共培养划痕实验显示伤口闭合率降低。
研究意义
作者提出,阻止中性粒细胞向HSV-1感染角膜的上皮层和基质层归巢可能具有临床意义,能够减轻HSK的严重程度。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

角膜HSV-1感染模型建立

建立HSV-1感染的小鼠角膜模型,以研究感染过程中免疫细胞的归巢。

用27G针头划伤C57BL/6J小鼠右眼角膜,滴加HSV-1悬液,在不同时间点(3、6、8、11、16天)处死小鼠。

2

角膜上皮与基质分离及单细胞制备

分离感染角膜的上皮层和基质层,制备单细胞悬液用于流式细胞术分析。

用Dispase II消化眼球,剥离上皮片,再用胰蛋白酶消化制备上皮单细胞悬液;剩余角膜基质用Liberase TL消化,并通过细胞筛制备基质单细胞悬液。

3

流式细胞术分析免疫细胞亚群

定量分析不同时间点角膜上皮层和基质层中CD45+白细胞、髓系细胞、单核细胞和中性粒细胞的频率和数量。

对单细胞悬液进行活/死染色、Fc阻断、表面抗体染色,使用BD LSRFortessa流式细胞仪采集数据,FlowJo软件分析。

4

单核细胞去除实验

验证上皮层中单核细胞对病毒播散和上皮细胞存活的影响。

在3 DPOI分离角膜上皮,用MACS柱去除CD45+或CD11b+细胞,培养后通过流式细胞术检测上皮细胞活性和病毒GFP表达。

5

中性粒细胞功能检测

评估上皮层中性粒细胞对角膜上皮伤口愈合的影响。

在16 DPOI纯化角膜上皮Ly6G+中性粒细胞,与hTCEpi单层细胞共培养,进行划痕实验,测量伤口闭合率。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
分散酶II----
Liberase TL----
胰蛋白酶-EDTA----
RPMI 1640培养基----
胎牛血清----
LIVE/DEAD固定化Aqua死细胞染色试剂盒InvitrogenL34966
抗CD45磁珠Miltenyi Biotec130-052-301
抗CD11b磁珠Miltenyi Biotec130-049-601
抗Ly-6G磁珠Miltenyi Biotec130-120-337
CD45-BV605抗体--Clone: 30-F11
CD326-APC/APC-Cy7抗体--Clone: G8.8
CD11b-PerCpCy5.5抗体--Clone: M1/70
Nkp46-BV421抗体--Clone: 29 A1.4
CD3e-PECy7抗体--Clone: 145-2C11
TCR-β-Alexa488抗体--Clone: H57-597
Ly6G-PECy7抗体--Clone: 1A8
Ly6C-Alexa700抗体--Clone: AL-21
Fc阻断剂(CD16/CD32抗体)----
BD LSRFortessa流式细胞仪BD Biosciences--
FlowJo软件--Version 10.10
GraphPad Prism软件GraphPadVersion 10.2.1
hTCEpi细胞系----
C57BL/6J小鼠Jackson Laboratoriesstock No. 000664
HSV-1 McKrae株----
HSV-1 McKrae-GFP株----
HSV-1 RE株----
Vero细胞American Type Cell CultureCCL81
27G半英寸针头----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
小鼠品系、年龄、性别、来源
阅读提示:Methods: Mice and HSV-1 strains
病毒感染
病毒株、滴度、感染体积、角膜划伤方式
阅读提示:Methods: Corneal HSV-1 infection
组织分离
上皮与基质分离方法、酶消化浓度和时间
阅读提示:Methods: Single cell preparation of individual corneal epithelium and corneal stroma
流式分析
抗体组合、圈门策略、样品处理和采集
阅读提示:Methods: Flow cytometry assay...及Figure 4-5图注
MACS去除
微珠类型、去除效率、培养时间
阅读提示:Methods: MACS column purification strategy, Figure 6
中性粒细胞纯化
纯化方法、纯度、剂量
阅读提示:Methods: Ly6G+ neutrophil purification..., Figure 7
划痕实验
细胞系、划痕方式、中性粒细胞数量、缺氧条件、孵育时间
阅读提示:Methods: Corneal epithelial scratch assay, Figure 7