角膜HSV-1感染模型建立
建立HSV-1感染的小鼠角膜模型,以研究感染过程中免疫细胞的归巢。
用27G针头划伤C57BL/6J小鼠右眼角膜,滴加HSV-1悬液,在不同时间点(3、6、8、11、16天)处死小鼠。
Differential homing of monocytes and neutrophils in the epithelial layer of HSV-1 infected cornea regulates viral dissemination and wound healing
包含小鼠感染模型、角膜上皮与基质分离、流式细胞术动力学分析、MACS细胞去除/纯化及体外上皮划痕伤口愈合功能验证,具备多层级实验验证。
C57BL/6J小鼠角膜HSV-1感染模型 HSV-1 McKrae、McKrae-GFP、RE感染角膜 hTCEpi人角膜上皮细胞系
小鼠品系、年龄和性别:8-12周龄雌性C57BL/6J小鼠 角膜感染方法:右眼角膜表面轻度划伤(共12次),滴加3 μL病毒悬液(McKrae: 1×10^3 pfu/眼;McKrae GFP: 1×10^5 pfu/眼) 取材时间点:3、6、8、11、16天感染后(DPOI) MACS细胞去除/纯化:CD45微珠、CD11b微珠、Ly6G微珠(Miltenyi Biotec) 流式圈门策略:CD45+、CD11b+、Ly6ChiLy6G-(单核细胞)、Ly6CloLy6Ghi(中性粒细胞)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立HSV-1感染的小鼠角膜模型,以研究感染过程中免疫细胞的归巢。
用27G针头划伤C57BL/6J小鼠右眼角膜,滴加HSV-1悬液,在不同时间点(3、6、8、11、16天)处死小鼠。
分离感染角膜的上皮层和基质层,制备单细胞悬液用于流式细胞术分析。
用Dispase II消化眼球,剥离上皮片,再用胰蛋白酶消化制备上皮单细胞悬液;剩余角膜基质用Liberase TL消化,并通过细胞筛制备基质单细胞悬液。
定量分析不同时间点角膜上皮层和基质层中CD45+白细胞、髓系细胞、单核细胞和中性粒细胞的频率和数量。
对单细胞悬液进行活/死染色、Fc阻断、表面抗体染色,使用BD LSRFortessa流式细胞仪采集数据,FlowJo软件分析。
验证上皮层中单核细胞对病毒播散和上皮细胞存活的影响。
在3 DPOI分离角膜上皮,用MACS柱去除CD45+或CD11b+细胞,培养后通过流式细胞术检测上皮细胞活性和病毒GFP表达。
评估上皮层中性粒细胞对角膜上皮伤口愈合的影响。
在16 DPOI纯化角膜上皮Ly6G+中性粒细胞,与hTCEpi单层细胞共培养,进行划痕实验,测量伤口闭合率。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 角膜上皮分离 | 分散酶II | -- | -- |
| 角膜基质分离 | Liberase TL | -- | -- |
| 角膜上皮单细胞制备 | 胰蛋白酶-EDTA | -- | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD固定化Aqua死细胞染色试剂盒 | Invitrogen | L34966 |
| MACS细胞分离 | 抗CD45磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-052-301 |
| 抗CD11b磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | |
| 抗Ly-6G磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-120-337 | |
| 流式细胞术 | CD45-BV605抗体 | -- | Clone: 30-F11 |
| CD326-APC/APC-Cy7抗体 | -- | Clone: G8.8 | |
| CD11b-PerCpCy5.5抗体 | -- | Clone: M1/70 | |
| Nkp46-BV421抗体 | -- | Clone: 29 A1.4 | |
| CD3e-PECy7抗体 | -- | Clone: 145-2C11 | |
| TCR-β-Alexa488抗体 | -- | Clone: H57-597 | |
| Ly6G-PECy7抗体 | -- | Clone: 1A8 | |
| Ly6C-Alexa700抗体 | -- | Clone: AL-21 | |
| Fc阻断剂(CD16/CD32抗体) | -- | -- | |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 数据分析 | FlowJo软件 | -- | Version 10.10 |
| GraphPad Prism软件 | GraphPad | Version 10.2.1 | |
| 细胞培养 | hTCEpi细胞系 | -- | -- |
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | Jackson Laboratories | stock No. 000664 |
| 病毒实验 | HSV-1 McKrae株 | -- | -- |
| HSV-1 McKrae-GFP株 | -- | -- | |
| HSV-1 RE株 | -- | -- | |
| 细胞培养 | Vero细胞 | American Type Cell Culture | CCL81 |
| 角膜划痕实验 | 27G半英寸针头 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、年龄、性别、来源 阅读提示:Methods: Mice and HSV-1 strains |
| 病毒感染 | 病毒株、滴度、感染体积、角膜划伤方式 阅读提示:Methods: Corneal HSV-1 infection |
| 组织分离 | 上皮与基质分离方法、酶消化浓度和时间 阅读提示:Methods: Single cell preparation of individual corneal epithelium and corneal stroma |
| 流式分析 | 抗体组合、圈门策略、样品处理和采集 阅读提示:Methods: Flow cytometry assay...及Figure 4-5图注 |
| MACS去除 | 微珠类型、去除效率、培养时间 阅读提示:Methods: MACS column purification strategy, Figure 6 |
| 中性粒细胞纯化 | 纯化方法、纯度、剂量 阅读提示:Methods: Ly6G+ neutrophil purification..., Figure 7 |
| 划痕实验 | 细胞系、划痕方式、中性粒细胞数量、缺氧条件、孵育时间 阅读提示:Methods: Corneal epithelial scratch assay, Figure 7 |