CRISPRa筛选鉴定肿瘤浸润增强因子
筛选能增强NK细胞向实体瘤迁移的基因。
利用定制和全基因组CRISPRa文库转导NK-92细胞，通过体内乳腺癌和卵巢癌模型以及体外趋化和球体浸润实验，结合scRNA-seq数据候选基因，鉴定出GPR183等代谢物感应GPCRs。
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利用代谢物感应受体工程化改造NK细胞和T细胞以靶向实体瘤
Engineering NK and T cells with metabolite-sensing receptors to target solid tumors
实验完整度
高包含体内CRISPRa筛选、体外趋化及球体浸润筛选、Perturb-seq转录组分析、多种体内疗效模型（NK、CAR NK、CAR T、OT-1 T）及功能验证。
主要模型
NK-92细胞 原代人NK细胞 原代人CD8+ T细胞 小鼠OT-1 T细胞
重点核对
NK-92细胞系 MDA-MB-231乳腺癌细胞系 TYK-nu卵巢癌细胞系 NSG小鼠和C57BL/6小鼠 GPR183过表达
摘要
自然杀伤（NK）细胞和T细胞需要浸润实体瘤以根除肿瘤。在这里，我们展示了利用代谢物感应受体将NK和T细胞动员到实体瘤的可编程机制。使用NK-92细胞进行的体内和体外CRISPR激活筛选确定GPR183、GPR84、GPR34和GPR18为浸润和趋化至乳腺癌和卵巢癌的最佳增强因子。虽然这些受体在内源性环境中仅在特定细胞背景下表达，但在NK和T细胞中表达这些受体可驱动其向癌细胞释放的因子迁移，并以配体依赖的方式改变NK细胞转录组。在NK、嵌合抗原受体（CAR）NK和CAR T细胞中表达GPR183可增加肿瘤浸润和控制。同样，在小鼠T细胞中表达GPR183可增强免疫活性小鼠中的肿瘤消除。这些数据表明，代谢物感应可以被重新布线以获得生化引导的空间靶向细胞，为治疗干预创造了新的可能性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用代谢物感应受体将NK和T细胞动员至实体瘤以增强肿瘤控制？
- 核心机制
- 代谢物感应受体（特别是GPR183）的异位表达使得淋巴细胞能够响应肿瘤微环境中的代谢物（如7α,25-OHC），从而增强其趋化和肿瘤浸润。
- 主要证据
- 通过体内和体外CRISPRa筛选鉴定thGPRs；GPR183过表达增强NK和T细胞迁移至肿瘤裂解液，体内实验中GPR183过表达NK及CAR T细胞肿瘤浸润增加并改善肿瘤控制。
- 研究意义
- 研究表明利用代谢物感应受体可重定向免疫细胞至肿瘤，为开发生化引导的细胞治疗策略提供了新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证GPR183等受体的配体和趋化功能
确认thGPRs的配体及其介导的细胞迁移。
通过PRESTO-Tango报告系统验证配体，并通过Transwell迁移实验检测过表达受体的NK-92细胞和原代细胞对配体及肿瘤条件培养基的迁移。
Perturb-seq分析GPR183的转录效应
评估GPR183激活对NK细胞转录组的影响及其配体依赖性。
用CRISPRa转导NK-92细胞，靶向GPR183等七个thGPRs，在有无7α,25-OHC处理下进行单细胞RNA测序，分析差异表达基因。
验证GPR183对肿瘤迁移和浸润的影响
验证GPR183过表达对NK/T细胞迁移和肿瘤浸润的影响。
利用transwell实验比较GPR183过表达细胞对肿瘤条件培养基和肿瘤裂解液的迁移，在体内通过共转移实验（NK-92）或CAR T细胞转移实验检测肿瘤浸润。
评估GPR183增强的体内抗肿瘤疗效
评估GPR183过表达对NK和T细胞治疗实体瘤的疗效。
在NSG小鼠中，用GPR183过表达的NK-92、CAR NK-92、CAR T细胞或OT-1 T细胞治疗荷瘤小鼠，监测肿瘤生长和生存期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
筛选基因功能
验证细胞迁移
评估体内疗效
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 61870036 |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | A3840102 | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 白细胞介素-2 | Frederick National Laboratory | -- | |
| 白细胞介素-15 | Frederick National Laboratory | -- | |
| 基质胶 | Corning | 354483 | |
| MEM非必需氨基酸溶液 | Cytiva | SH30598.01 | |
| 转染 | Lenti-X 293T细胞 | Takara Bio | 632180 |
| CRISPR筛选 | pKVL2-U6gRNA_SAM(BbsI)-PGKpuroBFP-W载体 | Addgene | 112925 |
| 人膜蛋白激活文库 | Addgene | 113345 | |
| dCas9-VP64-GFP | Addgene | 61422 | |
| lentiMPH V2 | Addgene | 89308 | |
| 潮霉素B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| PRESTO-Tango assay | Bright-Glo荧光素酶检测试剂 | Promega | E2610 |
| 流式细胞术 | 7-AAD | Sigma-Aldrich | SML1633 |
| 抗人CD182 (CXCR2)-Alexa Fluor 647抗体 | Biolegend | 320714 | |
| 抗人CD88 (C5AR1)-PE抗体 | Biolegend | 344303 | |
| 抗人GPR183-Alexa Fluor 647抗体 | Biolegend | 368903 | |
| 抗人CD326 (EpCAM)-APC抗体 | Biolegend | 324207 | |
| 抗人CD16-APC抗体 | Biolegend | 980104 | |
| 抗人CXCR6-APC抗体 | Biolegend | 356005 | |
| 抗人CD3-VioGreen抗体 | Miltenyi Biotech | 130-113-134 | |
| 抗人CD8a-VioBlue抗体 | Miltenyi Biotech | 130-113-162 | |
| 抗人TCRα/TCRβ-APC抗体 | Biolegend | 306717 | |
| 抗人CD56-APC抗体 | Miltenyi Biotech | 130-113-305 | |
| 抗小鼠CD45-APC/Cyanine7抗体 | Biolegend | 103116 | |
| 抗小鼠H-2Kb结合SIINFEKL抗体 | Biolegend | 141603 | |
| 抗人CD45抗体 | Biolegend | 368510 | |
| 细胞分选 | Sony Biotechnology SH800S细胞分选仪 | Sony Biotechnology | -- |
| Perturb-seq | Chromium Next GEM 单细胞5'试剂盒v2 | 10x Genomics | CG000510 |
| 细胞处理 | TrypLE消化液 | Gibco | 12605010 |
| 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | H7509 | |
| 细胞分离 | Ficoll-Paque Premium分离液 | Cytiva | 17-5442-02 |
| EasySep人CD8+ T细胞分选试剂盒 | STEMCELL Technologies | 17953 | |
| EasySep人NK细胞分选试剂盒 | STEMCELL Technologies | 17955 | |
| EasySep小鼠CD8+ T细胞分选试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19853 | |
| 细胞培养 | NK MACS培养基 | Miltenyi | 130-114-429 |
| EliteGro-Adv人血小板裂解物 | Elite Cell | EPA-050 | |
| 细胞刺激 | NK细胞激活/扩增试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-094-483 |
| 病毒转导 | Retronectin重组人纤连蛋白片段 | Takara | T100A |
| 细胞处理 | 红细胞裂解液 | Sigma | R7757 |
| 细胞培养 | β-巯基乙醇 | Sigma | M6250 |
| Dynabeads磁珠 | Gibco | 11131D | |
| 热灭活人AB血清 | MilliporeSigma | H4522 | |
| 细胞刺激 | PMA/离子霉素 | -- | -- |
| 细胞培养 | D-荧光素 | Abcam | ab143655 |
| 克隆 | pLV-EF1a-IRES-Blast载体 | Addgene | 85133 |
| BamHI-HF限制酶 | New England Biolabs | R3136 | |
| EcoRI-HF限制酶 | New England Biolabs | R3101 | |
| 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | ant-bl-05 | |
| 细胞培养 | pBMN-mGFP载体 | Addgene | 188643 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPRa筛选 | NK-92细胞表达dCas9-MPH系统、sgRNA文库构建、MOI（<0.3）、筛选时间（24小时体内乳腺癌、1-3周卵巢癌）、对照（NTC sgRNA） 阅读提示：Methods: CRISPRa NK-92 cell libraries; In vivo NK CRISPRa tumor infiltration screens |
| 体外迁移实验 | Transwell孔径（8 µm）、细胞数（2.5×10^6）、条件培养基类型（MDA-MB-231或MCF7）、孵育时间（4小时）、配体浓度（如100 nM 7α,25-OHC） 阅读提示：Methods: Chemoattraction NK CRISPRa screen; Extended Data Fig. 3 |
| Perturb-seq | sgRNA设计（每个基因3个sgRNA）、处理条件（100 nM 7α,25-OHC 4小时）、单细胞RNA-seq平台（10x Chromium）、分析标准（MAST, FDR<0.1） 阅读提示：Methods: Perturb-seq library and sequencing; Perturb-seq data analyses |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系（NSG或hIL-2-NOG）、肿瘤细胞系（MDA-MB-231或TYK-nu）、肿瘤接种方式（皮下、原位或腹腔）、肿瘤细胞数（5×10^6或3×10^6）、治疗细胞数（10^7或4×10^6）、给药途径（静脉或腹腔）、给药时间（每周一次或一次） 阅读提示：Methods: In vivo NK CRISPRa tumor infiltration screens; Disease outcome experiments |
| CAR T细胞实验 | CAR构建（anti-EpCAM）、T细胞来源（人PBMC）、转导方法、肿瘤模型（EpCAM过表达MDA-MB-231）、细胞剂量（4×10^6）、治疗时间（第13天） 阅读提示：Methods: CAR construct design; Human primary CD8+ T cell isolation; Fig. 6 |
| OT-1 T细胞实验 | OT-1 T细胞小鼠品系、E0771-OVA细胞系、肿瘤接种（2.5×10^6）、T细胞剂量（10^5）、治疗时间（第8天） 阅读提示：Methods: Mouse T cell isolation; Fig. 7 |