高通量筛选及候选药物鉴定
从FDA批准的药物库中筛选出对TCL细胞系具有强抗增殖活性的化合物。
使用CCK8法检测2945种药物处理三种TCL细胞系（HuT78、Karpas299、SNK-6）后的细胞活力，通过Venn图、3D散点图和热图分析，确定强心苷类药物（包括LATC）为最强效候选。
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通过小分子抑制剂靶向表观遗传调控T细胞淋巴瘤中的MYC
Targeting MYC in T-Cell lymphoma via epigenetic modulation with a small-molecule inhibitor
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、体内CDX和PDX模型、患者样本分析、多组学及机制验证（如RNA pull-down、RIP、ChIP、泛素化实验）等两个以上独立证据层级。
主要模型
TCL细胞系（Karpas299、HuT78、SNK-6、NK-92） NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型 NOD-SCID小鼠尾静脉注射转移模型 PTCL-NOS患者来源的PDX模型（NPI小鼠）
重点核对
LATC处理浓度：HuT78 100nM，Karpas299 200nM，SNK-6 75nM，NK-92 100nM 动物模型中LATC给药剂量：3mg/kg，每天腹腔注射 细胞活力检测使用CCK8试剂盒 侵袭实验使用Matrigel包被的Transwell小室，孵育36小时 PDX模型：肿瘤体积达约75mm3时开始给药
摘要
T细胞淋巴瘤（TCL）是一种异质性极高的侵袭性恶性肿瘤，因治疗选择有限而临床预后不良。因此，针对TCL的靶向治疗策略需求迫切。超过90%的TCL患者中观察到MYC上调，且与肿瘤进展相关。因此，靶向MYC可能成为TCL的一种有吸引力的治疗策略。在此，我们通过使用FDA批准的药物库进行无偏高通量筛选，鉴定出Lanatoside C（LATC）作为一种强效抗TCL药物。LATC在荷瘤小鼠和临床前PDX模型中均抑制了TCL的细胞增殖和侵袭能力。机制上，LATC通过结合并阻断YBX1的RNA识别结构域，干扰m5C阅读器YBX1与m5C修饰的MYC mRNA之间的相互作用，从而降低MYC mRNA的稳定性。同时，LATC直接靶向致癌性p300，通过抑制UCHL3介导的p300去泛素化增强其蛋白酶体降解，进而下调MYC启动子上的H4K16乳酸化以抑制其转录。总之，我们确定LATC作为一种表观遗传药物，通过双重靶向转录后YBX1/MYC mRNA稳定性和转录p300/H4K16乳酸化来抑制MYC驱动的T细胞淋巴瘤进展，为MYC过表达患者提供了一种新的靶向治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TCL中MYC过表达是否可通过靶向表观遗传调控因子（YBX1和p300）间接抑制，从而发挥抗肿瘤作用？
- 核心机制
- LATC通过双重机制下调MYC：一是通过结合YBX1的RNA识别结构域，阻断其与m5C修饰的MYC mRNA 3'UTR结合，降低MYC mRNA稳定性；二是通过增强p300的蛋白酶体降解（抑制UCHL3介导的去泛素化），减少MYC启动子上的H4K16乳酸化，抑制MYC转录。
- 主要证据
- RNA pull-down和质谱验证LATC与YBX1、p300相互作用；RNA稳定性、RIP、双荧光素酶报告基因实验证实LATC抑制YBX1介导的m5C识别和MYC mRNA稳定性；Western blot和ChIP显示LATC降低p300蛋白水平及MYC启动子H4K16乳酸化；体内皮下移植瘤、尾静脉转移和PDX模型显示LATC抑制肿瘤生长和侵袭。
- 研究意义
- 本研究将LATC鉴定为一种表观遗传药物，通过双重靶向MYC调控通路抑制TCL进展，为MYC过表达的TCL患者提供新的靶向治疗策略，并可能扩展到其他乳酸化相关疾病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LATC体外抗肿瘤活性验证
验证LATC对TCL细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。
用不同浓度LATC处理TCL细胞（HuT78、Karpas299、SNK-6、NK-92）48小时，进行CCK8细胞活力、Transwell细胞侵袭和Annexin V-FITC凋亡检测。
体内抗肿瘤药效评估
评估LATC在体内对TCL肿瘤生长和转移的抑制作用。
建立皮下移植瘤模型（Karpas299/SNK6细胞接种NOD-SCID小鼠）、尾静脉注射转移模型（Karpas299-luc细胞）和PTCL-NOS PDX模型，给予LATC（3mg/kg，每天腹腔注射）或溶剂对照，观察肿瘤体积、体重、生物发光信号及组织病理学变化。
LATC下调MYC表达及mRNA稳定性机制解析
明确LATC是否通过影响MYC mRNA稳定性来下调MYC表达。
通过蛋白质组学分析、TRRUST上游调控子预测、Western blot检测MYC、p53、E2F1表达，RT-qPCR检测MYC mRNA水平，RNA稳定性实验（放线菌素D处理）评估MYC mRNA半衰期，GSEA分析MYC致癌特征。
LATC靶向YBX1介导的m5C依赖性MYC mRNA稳定性
验证LATC是否通过结合YBX1阻断其识别m5C修饰的MYC mRNA，从而降低MYC mRNA稳定性。
通过生物素标记LATC pull-down和质谱鉴定相互作用蛋白，结合RBPDB和PubMed筛选得到YBX1。RNA pull-down验证YBX1与m5C修饰的MYC 3'UTR结合，分子对接预测结合模式，RIP验证LATC降低YBX1与MYC mRNA结合，双荧光素酶报告基因验证依赖YBX1和m5C的调控，并通过YBX1过表达挽救实验验证功能。
LATC抑制p300介导的H4K16乳酸化及MYC转录
验证LATC是否通过降低p300水平减少MYC启动子H4K16乳酸化，抑制MYC转录。
Western blot检测多种组蛋白修饰，ChIP检测MYC启动子上H4K16乳酸化水平，siRNA敲降和过表达实验验证p300对H4K16la和MYC的调控，泛素化实验和Co-IP验证LATC促进p300降解及破坏其与UCHL3相互作用，最终用p300-core过表达挽救实验证实功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞功能检测
RNA-蛋白质相互作用验证
染色质与转录调控分析
体内药效评估
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物筛选 | FDA批准药物库 | MedChemExpress | HY-L022M |
| 细胞活性检测 | 细胞计数试剂盒-8 | -- | -- |
| 细胞侵袭检测 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C1062L |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | Hiscript III逆转录酶 | Vazyme Biotech | -- |
| SYBR PCR预混液 | Vazyme Biotech | -- | |
| 实时PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 蛋白质印迹 | 抗MYC抗体 | CST | 9402 |
| 抗YB-1抗体 | Abcam | ab76149 | |
| 抗p53抗体 | Abcam | ab26 | |
| 抗E2F1抗体 | Proteintech | 66515-1-IG | |
| 抗H3K4me3抗体 | PTM BIO | PTM-613 | |
| 抗H3K9me3抗体 | PTM BIO | PTM-616 | |
| 抗H3K27me3抗体 | PTM BIO | PTM-647RM | |
| 抗H3K27ac抗体 | PTM BIO | PTM-116RM | |
| 抗H3K9ac抗体 | PTM BIO | PTM-112RM | |
| 抗H3K9la抗体 | PTM BIO | PTM-1419RM | |
| 抗H3K14la抗体 | PTM BIO | PTM-1414RM | |
| 抗H3K18la抗体 | PTM BIO | PTM-1406RM | |
| 抗H4K12la抗体 | PTM BIO | PTM-1411RM | |
| 抗H4K16la抗体 | PTM BIO | PTM-1417RM | |
| 抗组蛋白H3抗体 | CST | 9715 | |
| 抗组蛋白H4抗体 | PTM BIO | PTM-1015RM | |
| 抗Flag标签抗体 | CST | 8146 | |
| 抗Myc标签抗体 | CST | 2278 | |
| 抗HA标签抗体 | CST | 3724 | |
| 抗p300抗体 | Abcam | ab275378 | |
| 抗CBP抗体 | CST | 7389 | |
| 抗KAT8抗体 | CST | 46862 | |
| 抗AARS1抗体 | Proteintech | 67909-1-IG | |
| 抗AARS2抗体 | Proteintech | 22696-1-IG | |
| 抗UCHL3抗体 | Abcam | ab241490 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| 原代T细胞分离 | T细胞分离试剂盒 | GenScript | L00896-1 |
| 原代T细胞培养 | X-VIVO 20无血清造血细胞培养基 | Lonza | 04-448Q |
| 人重组白细胞介素-2 | Miltenyi Biotec | -- | |
| Dynabeads人T细胞激活剂CD3/CD28 | STEMCELL | 10971 | |
| siRNA转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 蛋白纯化 | 抗Flag磁珠 | -- | -- |
| 3×FLAG多肽 | MedChemExpress | HY-P0319 | |
| Amicon Ultra离心过滤器 | Millipore | UFC201024 | |
| RNA pull-down | RNA-蛋白质pull-down试剂盒 | Thermo | -- |
| LATC pull-down与质谱 | 链霉亲和素磁珠 | -- | -- |
| RNA免疫沉淀 | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| 染色质免疫沉淀 | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | Dual-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | -- |
| 流式细胞术 | 抗人CD3-APC-Cy7抗体 | Biolegend | -- |
| 抗人CD4-PE抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗人CD8a-VP450抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗人NK1.1-FITC抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗人F4/80-PE抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗人Mac1-V450抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗人B220-FITC抗体 | Biolegend | -- | |
| 动物实验 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
| 聚乙二醇300 | -- | -- | |
| 吐温-80 | -- | -- | |
| 生理盐水 | -- | -- | |
| 组织病理学 | 抗Ki-67抗体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 药物筛选 | 药物库来源（MedChemExpress，Cat# HY-L022M），筛选浓度1 µmol/L，处理时间48小时，细胞系为HuT78、Karpas299、SNK-6。 阅读提示：Materials and methods：FDA-approved drug library screening；Fig. 1A-C |
| 体外细胞活性实验 | 每种细胞系的具体LATC处理浓度（HuT78 100nM，Karpas299 200nM，SNK-6 75nM，NK-92 100nM），处理时间48小时，细胞接种数量（CCK8为5×10³细胞/孔）。 阅读提示：Materials and methods：Cell culture, CCK8 assay；Fig. 1G-J |
| 细胞侵袭实验 | Transwell小室（Corning）包被Matrigel（BD Biosciences），细胞预处理LATC 48小时，上室无血清培养基，下室含20% FBS，孵育36小时。 阅读提示：Materials and methods: Cell invasion assay; Fig. 1G-J |
| 体内移植瘤模型 | 小鼠品系（NOD-SCID），细胞接种数量（1×10⁷ TCL细胞皮下注射），给药剂量（LATC 3mg/kg，腹腔注射，每日一次），起始治疗时肿瘤体积（约75-100mm3），测量项目（肿瘤体积、体重）。 阅读提示：Materials and methods: In vivo animal assays; Fig. 2A-D |
| 尾静脉转移模型 | Karpas299-luc细胞数量（5×10⁶），尾静脉注射，给药方案（LATC 3mg/kg，每日一次，连续8天，第16天开始），生物发光成像时间点（第16、19、24天）。 阅读提示：Materials and methods: In vivo animal assays; Fig. 3A |
| PDX模型 | PDX模型来源（北京IDMO），小鼠品系（NPI小鼠），肿瘤体积达50mm3时开始给药，LATC剂量3mg/kg腹腔注射每天。 阅读提示：Materials and methods: In vivo animal assays; Fig. 2F |
| RNA稳定性实验 | 放线菌素D处理浓度（5 µg/ml），处理时间点（0, 30, 60, 90分钟），LATC预处理的浓度和时间（48小时）。 阅读提示：Materials and methods: RNA-stability assay; Fig. 4F-I |
| RNA pull-down | 生物素标记MYC RNA片段（CDS和3'UTR）是否含有m5C修饰，RNA pull-down试剂盒（Thermo）。 阅读提示：Materials and methods: RNA pull-down assay; Fig. 5C-D |
| RIP实验 | 抗YBX1抗体使用量（2 µg），磁珠（Protein G magnetic beads），是否使用RNase抑制剂。 阅读提示：Materials and methods: RNA immunoprecipitation (RIP); Fig. 5G |
| ChIP实验 | 抗H4K16la抗体，甲醛固定（1%），微球菌核酸酶消化（0.5 µl/反应），检测区域：MYC启动子。 阅读提示：Materials and methods: Chromatin immunoprecipitation (ChIP); Fig. 6B |
| 泛素化实验 | 质粒（Ub-Myc和p300-HA）共转染HEK293T细胞，LATC处理浓度和时间（100nM，48小时）。 阅读提示：Materials and methods: Co-immunoprecipitation, ubiquitination assay; Fig. 7F |