TCGA STAD肿瘤的层次聚类分类
基于158基因特征对TCGA STAD肿瘤进行层次聚类，以重新定义Claudinlow亚组。
对TCGA STAD肿瘤的基因表达数据进行方差稳定变换，使用SigClust2和158基因特征进行层次聚类，得到Claudinlow亚组。
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一个基因表达特征定义了胃腺癌中Claudins低表达且NF-YA长/NF-YA短剪接变异比率高的亚型
A gene-expression signature defines a subtype of Stomach Adenocarcinomas with low levels of Claudins and a high ratio of NF-YA long/NF-YA short splicing variants
实验完整度
中包含基于TCGA、独立数据集和细胞系的转录组分析，并通过qRT-PCR和Western blot进行验证，但缺乏体内功能实验或机制验证。
主要模型
TCGA STAD肿瘤样本 CCLE STAD细胞系 独立STAD患者样本数据集
重点核对
TCGA STAD肿瘤样本的158基因特征表达 CCLE STAD细胞系的158基因特征表达 qRT-PCR验证的CLDN3、CLDN4、CLDN7、VIM、CDH1、NF-YAl、NF-YAs mRNA表达 Western blot验证的NF-YAl、NF-YAs、VIM、CDH1蛋白表达
摘要
背景：Claudin-3、Claudin-4和Claudin-7在上皮细胞表面表达。在上皮来源的肿瘤细胞中，它们的缺失是不同癌症的侵袭性标志。NF-YA基因编码核转录因子Y亚基A，其在多种肿瘤中过表达。在肿瘤中，NF-YA的两个主要选择性剪接异构体NF-YA长和NF-YA短的相对比率与间质表型和不良预后相关。基于高NF-YA长/NF-YA短比率，我们生成了一个158基因特征，该特征在Claudinlow乳腺癌（BRCA）和胃腺癌（STAD）中常见。方法：为了更好地对STAD Claudinlow肿瘤进行分类，我们采用了基于158基因特征的层次聚类方法，将STAD分类为Claudinlow亚组。我们在TCGA以及另外两个肿瘤数据集中测试了该特征的分类潜力。我们使用深度学习工具DeepCC和158基因特征对CCLE平台中可用的STAD细胞系进行分类。获得的数据通过qRT-PCR和Western blots进行验证。结果：158基因特征选择出了一个STAD亚组，该亚组具有有效的Claudinlow表达和高NF-YA长/NF-YA短比率。该Claudinlow亚组与STAD的EMT亚组分离，并以不良临床结局为特征。我们鉴定了9个具有高NF-YA长/NF-Y短比率的Claudinlow STAD细胞系，并验证了选定标志物的表达。结论：我们的工作支持这样的观点：三个重叠特征——Claudin-3/4/7低表达、高NF-YA长/NF-YA短比率和158基因特征——标记了STAD的一个特定亚组，该亚组以间质特征和不良预后为特征。补充信息：在线版本包含补充材料，可在10.1007/s10120-025-01671-1获取。关键词：STAD肿瘤分类，细胞系，Claudinlow，NF-YA
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 基于158基因特征能否更准确地定义STAD中的Claudinlow亚型，并验证其与Claudin表达及NF-YA剪接比率的关系。
- 核心机制
- STAD中存在一个以低Claudin-3/4/7表达、高NF-YAl/NF-YAs比率和158基因特征为标志的亚组，该亚组与间质表型和不良预后相关。
- 主要证据
- 基于TCGA和两个独立数据集的RNA-seq数据进行层次聚类识别Claudinlow亚组，并通过qRT-PCR和Western blot在6个细胞系中验证标志物表达。
- 研究意义
- 该研究为STAD的Claudinlow亚型提供了更精确的分子定义，可能有助于改进肿瘤分类和预后判断。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
独立数据集的验证
在独立数据集（PRJNA764173和PRJNA1119255）中验证158基因特征对Claudinlow亚组的分类能力。
对231例和60例STAD样本进行层次聚类，识别出Claudinlow亚组，并分析其Claudin和NF-YA表达。
CCLE STAD细胞系的分类
利用DeepCC和158基因特征对CCLE中的STAD细胞系进行重新分类，以识别Claudinlow细胞系。
使用DeepCC基于已有分类进行训练，然后使用ssGSEA和158基因特征计算z-score，将z-score>1的细胞系分类为Claudinlow。
细胞系标志物验证
通过qRT-PCR和Western blot验证所选STAD细胞系中CLDN3/4/7、VIM、CDH1、NF-YAl、NF-YAs的表达。
对HS746T、LMSU、MKN7、NCIN87、MKN45和AGS细胞系进行qRT-PCR和Western blot分析，以验证RNA-seq数据。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Euroclone | ECB9006L |
| 胎牛血清 | Euroclone | ECS0165L | |
| L-谷氨酰胺 | Euroclone | ECB3000D | |
| 青霉素/链霉素 | Euroclone | ECB3001D | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Sigma Aldrich | T9424 |
| 反转录 | M-MLV SuperMIX 5X + M-MLV混合液 | Genespin | STS-MSX |
| Western blot | 抗Vinculin抗体 | Sigma-Aldrich | 05-386 |
| 抗β-tubulin抗体 | Sigma-Aldrich | T5293 | |
| 抗NF-YA G2抗体 | Santa Cruz Biotech. | sc-17753 | |
| 抗CDH1抗体 | BD Biosciences. | 610181 | |
| 抗Vimentin抗体 | Cell Signaling | D21H3 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠二抗 | Sigma-Aldrich | A4416 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗 | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| qRT-PCR | CFX Connect实时荧光定量PCR系统 | BIO-RAD | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 层次聚类分类 | TCGA STAD肿瘤样本数量（415）、使用的158基因特征、SigClust2参数（Ward.D2连接、曼哈顿距离） 阅读提示：Materials and methods: Hierarchical clustering and Claudinlow subtype re-classification of the TCGA STAD tumors |
| 独立数据集验证 | 数据集（PRJNA764173、PRJNA1119255）样本数（231和60）、层次聚类方法 阅读提示：Materials and methods: STAD RNA-seq data and molecular classifications; Results: Use of the 158-gene signature to classify additional STAD cases |
| 细胞系分类 | CCLE STAD细胞系数量（50）、DeepCC训练集分类、ssGSEA z-score阈值（>1） 阅读提示：Materials and methods: Re-classification of the STAD cell-lines; Results: A novel classification of the STAD cell lines |
| qRT-PCR验证 | 细胞系（HS746T、LMSU、MKN7、NCIN87、MKN45、AGS）、引物序列（补充表1） 阅读提示：Materials and methods: qRT-PCR and western blot analyses; Results: A novel classification of the STAD cell lines |
| Western blot验证 | 抗体列表、蛋白提取方法、上样量（30 µg） 阅读提示：Materials and methods: qRT-PCR and western blot analyses; Results: A novel classification of the STAD cell lines |