PRISM药物敏感性筛选
比较MTAC-PRMT5i和第一代PRMT5抑制剂在大量细胞系中的选择性，并识别MTAP缺失作为生物标志物。
在超过900个条形码细胞系中，用MTAC-PRMT5i（MRTX1719、MRTX9768、TNG908）和第一代PRMT5抑制剂（pemrametostat）处理，并计算AUC和IC50。
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CRISPR-药物组合筛选鉴定MTAP缺失癌症的有效联合治疗方案
CRISPR-Drug Combinatorial Screening Identifies Effective Combination Treatments for MTAP-Deleted Cancer
实验完整度
高包含PRISM筛选、CRISPR药物组合筛选、体外细胞系和类器官验证、体内异种移植模型、耐药机制研究及RNA-seq等多层次实验，并进行了功能验证。
主要模型
非小细胞肺癌细胞系LU99、SW1573 胰腺导管腺癌细胞系MiaPaCa2、KP4、PANC02.13、SNU410 患者来源的胰腺导管腺癌类器官 LU99异种移植小鼠模型
重点核对
MTAP缺失和RAS-MAPK通路激活状态（如KRAS突变） MTAC-PRMT5i和MAPK通路抑制剂（如ulixertinib、adagrasib、belvarafenib）的剂量和给药方案 药物组合的协同效应（Loewe评分） 体内实验中药物剂量（如MRTX1719 50mg/kg，adagrasib 50mg/kg，belvarafenib 30mg/kg）及给药方式（口服灌胃） 非交叉耐药性的验证（KRAS抑制剂耐药和PRMT5抑制剂耐药的产生方法）
摘要
CDKN2A/MTAP共缺失在非小细胞肺癌及其他实体瘤（包括胶质母细胞瘤和胰腺导管腺癌）中频繁发生。肺癌仍是癌症相关死亡的主要原因，而胶质母细胞瘤或胰腺癌患者的5年生存率不足15%，这凸显了对更有效疗法的需求[1]， [2]， [3]， [4]， [5]。PRMT5是MTAP缺失肿瘤中的合成致死依赖靶点，也是CDKN2A/MTAP缺失癌症的有吸引力的治疗靶点。一类新型革命性抑制剂，称为MTA协同PRMT5抑制剂，在正在进行的早期临床试验中显示出有希望的结果。尽管如此，有效的癌症治疗通常需要治疗组合来提高缓解率并击败新出现的耐药克隆。因此，我们试图确定其他通路的扰动是否能提高MTA协同PRMT5抑制剂的疗效。使用旁系同源基因和单基因靶向CRISPR文库，我们在存在或不存在MTA协同PRMT5抑制剂的情况下筛选了MTAP缺失的癌症。多个基因的缺失使细胞对PRMT5抑制敏感，包括MAPK通路的成员。使用KRAS、MEK、ERK和RAF抑制剂对MAPK通路成员进行化学抑制，与PRMT5抑制协同杀死CDKN2A/MTAP缺失、RAS活化的肿瘤。此外，MTA协同PRMT5抑制剂与KRAS或RAF抑制剂联合在体内导致完全缓解，强调了患者的潜在获益。最后，对KRAS抑制耐药的细胞系对MTA协同PRMT5抑制剂不耐药，反之亦然，表明存在非交叉反应性耐药机制。总的来说，本研究确定了MTA协同PRMT5抑制剂与可能为患者带来显著获益的治疗组合。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MTAC-PRMT5i与其他通路抑制剂联合使用是否能提高对MTAP缺失癌症的疗效？
- 核心机制
- MTAC-PRMT5i治疗激活RAS信号通路，而联合使用MAPK通路抑制剂（如KRAS、MEK、ERK、RAF抑制剂）可阻断该补偿性激活，从而协同抑制肿瘤生长；此外，两种抑制剂具有非交叉耐药机制。
- 主要证据
- 通过CRISPR筛选发现MAPK通路基因是MTAC-PRMT5i的增敏靶点；体外实验验证了MTAC-PRMT5i与多种MAPK抑制剂（如ulixertinib、adagrasib、belvarafenib）的协同效应；体内LU99异种移植模型证实联合治疗可诱导完全缓解。
- 研究意义
- 该研究为MTAP缺失且RAS-MAPK通路激活的肿瘤患者提供了有前景的组合治疗策略，并提示MTAC-PRMT5i可能是KRAS抑制剂耐药后的有效二线治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CRISPR-Cas9药物组合筛选
鉴定与MTAC-PRMT5i联合使用时可增敏的基因或基因对。
在CDKN2A/MTAP缺失的NSCLC细胞系LU99和SW1573中引入旁系同源基因和单基因靶向CRISPR文库，并用MTAC-PRMT5i（MRTX9768、MRTX1719）或DMSO处理，通过测序分析基因耗竭。
体外药物组合验证
验证MAPK通路抑制剂与MTAC-PRMT5i联合对MTAP缺失、RAS活化的癌细胞生长的协同抑制作用。
在多种MTAP缺失、RAS突变的NSCLC和PDAC细胞系及患者来源类器官中，使用MTAC-PRMT5i（MRTX1719）与ERK抑制剂（ulixertinib）、MEK抑制剂（trametinib）、KRAS抑制剂（adagrasib、RMC-7977）或pan-RAF抑制剂（belvarafenib）联合处理，评估细胞活力、集落形成和协同评分。
体内联合治疗效果评估
评估MTAC-PRMT5i与KRAS或RAF抑制剂联合在体内的抗肿瘤疗效。
将LU99细胞皮下接种至裸鼠，待肿瘤平均体积达~180mm³后，随机分组，分别给予MRTX1719、adagrasib、belvarafenib或联合治疗32天，并监测肿瘤体积和复发。
耐药机制评估
评估MTAC-PRMT5i与MAPK抑制剂之间是否存在非交叉耐药性。
分别建立对MRTX1719耐药的MiaPaCa2细胞系和对KRAS抑制剂耐药的SNU410细胞系（过表达KRAS或MYC），并检测它们对另一类抑制剂的敏感性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Fisher Scientific | -- |
| RPMI-1640 Glutamax培养基 | Fisher Scientific | -- | |
| DMEM/F-12培养基 | Fisher Scientific | -- | |
| McCoy's 5A培养基 | Fisher Scientific | -- | |
| Leibovitz's L-15培养基 | Fisher Scientific | -- | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Fisher Scientific | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 杀稻瘟菌素 | -- | -- | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | -- | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Plus 迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 逆转录 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qPCR | Fast SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | -- |
| Oligo(dT)引物 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo 3D试剂 | Promega | -- |
| CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂 | Promega | G7571 | |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | Sigma-Aldrich | -- |
| 福尔马林 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 乙酸 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 文库构建 | Titanium Taq DNA聚合酶 | Takara Bio | -- |
| NucleoSpin Blood XL 提取试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| Agencourt AMPure XP SPRI磁珠 | Beckman Coulter | A63880 | |
| 测序 | Illumina NextSeq500测序仪 | Illumina | -- |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 药物处理 | MRTX1719 | MedChemExpress | HY-139611 |
| MRTX9768 | MedChemExpress | HY-138684 | |
| TNG908 | MedChemExpress | HY-148419 | |
| 帕瑞司他 | MedChemExpress | HY-101563 | |
| RMC7977 | MedChemExpress | HY-156498 | |
| Ulixertinib | MedChemExpress | HY-15816 | |
| 维奈克拉 | MedChemExpress | HY-15531 | |
| 阿达格拉西布 | MedChemExpress | HY-130149 | |
| 曲美替尼 | MedChemExpress | HY-10999 | |
| Belvarafenib | MedChemExpress | HY-109080 | |
| MRTX1133 | MedChemExpress | HY-134813 | |
| Navitoclax | Selleckchem | S1001 | |
| 抗体 | IRDye 680RD山羊抗小鼠IgG二抗 | LI-COR Biosciences | 926-68070 |
| IRDye 800CW山羊抗兔IgG二抗 | LI-COR Biosciences | 926-32211 | |
| Vinculin抗体 | Sigma-Aldrich | V9131-100UL | |
| Phospho-FRA1 (Ser 265)抗体 | Cell Signaling Technology | 5841S | |
| SDMA抗体 | Cell Signaling Technology | 13222S | |
| P21/Waf1/Cip1抗体 | Cell Signaling Technology | 2947T | |
| Phospho-Rb抗体 | Cell Signaling Technology | 8516S | |
| Total RAS抗体 | Cell Signaling Technology | 67648 | |
| B-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| MYC抗体 | Cell Signaling Technology | 5605 | |
| Phospho-ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9101S | |
| Total ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4696S |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系身份和来源（如ATCC、RIKEN），培养基类型，血清浓度，培养条件（温度、CO2浓度） 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture |
| 药物处理 | 药物浓度（如MRTX1719 10nM或20nM），处理时间（7天或14天），溶剂对照（DMSO） 阅读提示：Materials and Methods: Drug treatments, Figure legends |
| CRISPR筛选 | 细胞系（LU99、SW1573），MOI（如0.2或0.27），细胞密度，药物浓度（如10nM MRTX9768或20nM MRTX1719），处理时间（21-25天），筛选代表度 阅读提示：Materials and Methods: Digenic paralogous CRISPR-Cas9 sensitizer screen |
| 体内实验 | 小鼠品系和性别（NCr裸鼠，雌性），细胞接种数量（5百万），药物剂量（如MRTX1719 50mg/kg，adagrasib 50mg/kg，belvarafenib 30mg/kg），给药方式（口服灌胃），治疗时长（32天），样本量（每组8只） 阅读提示：Materials and Methods: In Vivo Mouse Studies |
| 耐药机制研究 | 耐药细胞系建立方法（如MiaPaCa2连续处理MRTX1719 10nM至15nM，SNU410过表达KRAS或MYC），检测药物（如MRTX1719、adagrasib、ulixertinib、belvarafenib、MRTX1133）及浓度范围 阅读提示：Materials and Methods: Generation of MTAC-PRMT5i-resistant and KRAS inhibitor-resistant cell lines |