评估化合物对AML细胞系的杀伤效果
确定HA344和#231对多种AML细胞系的细胞毒性及LD50。
使用5种AML细胞系（HL-60、OCI-AML3、MV4-11、NB4、MOLM-14），暴露于不同浓度（0.5-5 µM）化合物48小时，通过DAPI染色和XTT法检测细胞死亡。
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双重靶向GPX4和TXNRD1通过诱导凋亡和铁死亡根除AML细胞
Dual targeting of GPX4 and TXNRD1 triggers eradication of AML cells through induction of apoptosis and ferroptosis
实验完整度
高涉及多种AML细胞系、患者骨髓样本、健康供体细胞；包含细胞活力、凋亡、铁死亡检测，RNA-seq、点击化学-质谱、蛋白质稳定性及活性分析等多层级验证。
主要模型
HL-60（人AML细胞系） OCI-AML3（人AML细胞系） MV4-11（人AML细胞系） AML患者骨髓原始细胞
重点核对
HA344和#231的浓度及处理时间（如48小时） AML细胞系类型（HL-60、OCI-AML3等） LD50浓度 GPX4和TXNRD1的蛋白表达及活性检测 患者样本的遗传学分类（中间/不良）
摘要
骨髓增生异常综合征（MDS）是与骨髓衰竭和造血细胞生长异常相关的血液疾病，常进展为急性髓系白血病（AML）。目前对AML和高危MDS的治疗效果有限，凸显了对新疗法的需求。近期研究表明，诱导铁死亡（单独使用或联合标准化疗）是治疗MDS/AML细胞的一种有前景的策略。在此，我们报告了两种新化合物HA344和#231，它们同时靶向铁死亡和凋亡通路，能有效根除MDS/AML细胞系和患者来源的骨髓原始细胞。RNA测序分析揭示氧化应激和凋亡是这些化合物在不同AML细胞系中激活的关键通路。细胞内点击化学实验结合质谱分析鉴定出谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和硫氧还蛋白还原酶1（TXNRD1）为这两种化合物的主要靶点，在微摩尔范围内抑制GPX4和TXNRD1。质谱分析证实HA344和#231共价结合GPX4；然而，对含硒GPX4（GPX4-Se）的亲和力高于含硫GPX4（GPX4-S）。这些发现将HA344和#231视为MDS/AML治疗的潜在治疗选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 寻找能够有效根除MDS/AML细胞的新型治疗分子，并阐明其作用机制。
- 核心机制
- HA344和#231共价结合GPX4和TXNRD1的硒代半胱氨酸活性位点，导致其降解，同时诱导凋亡和铁死亡。
- 主要证据
- 在多种AML细胞系（HL-60、OCI-AML3等）和患者样本中，化合物诱导caspase激活、脂质过氧化和细胞死亡；点击化学-质谱鉴定靶点；基因敲低和药理学抑制实验证实GPX4主要贡献铁死亡，TXNRD1主要贡献凋亡。
- 研究意义
- HA344和#231可作为MDS/AML的潜在治疗选择，尤其是对FLT3突变的高危亚组，且与Venetoclax联用具有加性效应。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估化合物对患者来源骨髓细胞的作用
验证化合物对AML患者骨髓原始细胞和健康供体细胞的杀伤选择性。
收集25例MDS/AML患者骨髓样本，按遗传学风险分组，用HA344和#231（1.25-5 µM）处理48小时，流式检测CD45+和CD45+/CD34+细胞死亡；同时检测健康供体PBMC和脐血CD34+细胞。
转录组分析揭示作用通路
探究HA344和#231对AML细胞基因表达的影响，识别关键调控通路。
对HL-60和OCI-AML3细胞用化合物处理10小时，进行RNA-seq分析，包括PCA、火山图、Venn图、GO和GSEA分析。
验证凋亡和铁死亡参与
确认HA344和#231诱导的细胞死亡是否依赖于凋亡和铁死亡。
使用凋亡抑制剂qVD、铁死亡抑制剂（Fer-1、Lip-1、deferoxamine、ciclopirox）预处理细胞，检测caspase活性、脂质过氧化、线粒体膜电位和ROS。
鉴定化合物靶蛋白
利用点击化学和质谱鉴定HA344和#231在AML细胞中的直接靶点。
使用含活性基团的探针（VG41、VG40）和阴性对照探针（VG43、VG60）处理HL-60、OCI-AML3、MV4-11细胞，进行点击反应、富集、质谱分析，并通过Western blot验证GPX4和TXNRD1结合。
验证化合物对GPX4和TXNRD1的抑制与降解
阐明化合物对GPX4和TXNRD1活性及稳定性的影响。
检测化合物处理后GPX4和TXNRD1的酶活性、蛋白稳定性（CETSA、nanoDSF）、蛋白降解情况，并使用siRNA和药理学抑制剂验证GPX4和TXNRD1分别对铁死亡和凋亡的贡献。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与处理 | HA344 | -- | -- |
| #231 | -- | -- | |
| 凋亡检测 | Q-VD-OPh | -- | -- |
| 铁死亡抑制 | Ferrostatin-1 | -- | -- |
| Liproxstatin-1 | -- | -- | |
| 去铁胺 | -- | -- | |
| 环吡酮 | -- | -- | |
| 活性氧检测 | DCFDA探针 | -- | -- |
| 线粒体功能检测 | TMRE探针 | -- | -- |
| MitoSOX探针 | -- | -- | |
| 脂质过氧化检测 | 脂质过氧化检测试剂盒 | -- | -- |
| TXNRD1活性检测 | 硫氧还蛋白还原酶检测试剂盒 | -- | -- |
| TXNRD1抑制 | Tri-1 | -- | -- |
| GPX4抑制 | FIN56 | -- | -- |
| 点击化学 | VG41 | -- | -- |
| VG43 | -- | -- | |
| VG40 | -- | -- | |
| VG60 | -- | -- | |
| 蛋白稳定性分析 | 纳米差示扫描荧光 | -- | -- |
| 细胞死亡检测 | DAPI | -- | -- |
| 细胞活力检测 | XTT | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系处理 | 细胞系类型、化合物浓度、处理时间（如48小时）、LD50值 阅读提示：见Methods及Figure 1 legend |
| 患者样本处理 | 患者遗传学分组、骨髓细胞处理浓度（1.25-5 µM）、处理时间（48小时） 阅读提示：见Figure 1 legend及Table S1 |
| 凋亡检测 | qVD浓度（20 µM）、caspase活性检测时间（24小时）、线粒体膜电位检测 阅读提示：见Figure 4 legend及Supplemental Figure 2 |
| 铁死亡检测 | 脂质过氧化检测时间（6-24小时）、铁死亡抑制剂浓度（Fer-1、Lip-1、deferoxamine） 阅读提示：见Figure 4及Supplemental Figure 3 |
| 靶点鉴定 | 探针浓度（2.5 µM）、处理时间（1小时）、细胞系 阅读提示：见Figure 6 legend及Methods |
| GPX4和TXNRD1活性 | GSH/GSSG检测、TXNRD1活性检测试剂盒使用条件 阅读提示：见Figure 7d和Figure 8c |