建立单细胞来源的子宫内膜上皮类器官模型
评估不同方法（顺序过滤、单细胞衍生、选择性贴壁）对建立均匀、可重复的EEOs的影响，以确定最佳方案。
取子宫内膜组织，经过消化、过滤、单细胞化或贴壁等方法处理，最终在Matrigel中培养形成类器官，并通过免疫荧光和细胞计数评估其纯度和形态。
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胚胎分泌组对子宫内膜上皮转录组的调控：建立用于评估胚胎活力的模型
Embryo secretome regulation of the endometrial epithelial transcriptome: development of a model to test for embryo viability
实验完整度
高研究包含体外类器官模型建立、蜕膜化验证、胚胎条件培养基处理、RNA-seq转录组分析及功能富集分析，涵盖模型建立、功能验证和机制探索，具有多层次实验证据。
主要模型
单细胞来源的人子宫内膜上皮类器官（EEOs） 胚胎培养上清液处理后的蜕膜化EEOs
重点核对
类器官来源于39岁已生育女性的子宫内膜 胚胎培养上清液来自形态学优质胚胎，根据妊娠结局分组（活产组 vs 未妊娠组） 类器官与胚胎上清液共培养时间为24小时 RNA-seq差异表达基因筛选阈值：调整后P值<0.05且|log2FC|>1 共培养时使用的胚胎上清液浓度为100%v/v
摘要
本研究旨在利用单细胞来源的子宫内膜上皮类器官开发一种先进的人子宫内膜体外模型，从而能够在母胎界面研究胚胎分泌组与子宫内膜之间的相互作用。取自一位已生育过的39岁女性的子宫内膜组织来源的单细胞类器官，通过SPP1和乙酰化α-微管蛋白的表达，重现了对激素反应的蜕膜化。当在胚胎培养基中培养时，类器官保持活力且无细胞毒性，但增殖受到抑制，这可能是由于类器官生长培养基中所需因子浓度较低所致。用具有已知妊娠结局（活产（n=4） vs 未妊娠（n=4））的形态学优质胚胎的培养上清液刺激类器官。转录组分析（RNA测序）显示，与未妊娠结局相比，暴露于活产胚胎培养上清液的类器官中有32个基因差异表达（DEGs）：24个上调，8个下调。这些DEGs富集了与细胞运动和细胞骨架动力学相关的生物学过程。总之，实现活产的人囊胚分泌的可溶性因子选择性地调节子宫内膜上皮转录组，增强涉及细胞骨架重塑和免疫调节的通路。这种胚胎导向的重塑可能促进子宫内膜容受性，以实现成功着床。我们的类器官模型为进一步研究着床失败提供了一个稳健的平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胚胎分泌组是否能够调节子宫内膜上皮的转录组，从而影响胚胎着床和妊娠结局。
- 核心机制
- 活产胚胎的分泌组通过上调与细胞骨架重塑和免疫调节相关的基因（如VWA5B1、ELAPOR1）以及下调DERL3和HPGD等基因，激活Wnt信号通路，促进子宫内膜容受性。
- 主要证据
- 基于单细胞来源的EEOs，经蜕膜化诱导后与胚胎培养上清液共培养，发现活产组与未妊娠组之间有32个差异表达基因，功能富集显示与细胞运动和细胞骨架动力学相关通路显著富集。
- 研究意义
- 该模型为研究着床失败提供了平台，并可能为改善辅助生殖技术结局提供新的靶点，如子宫内膜容受性生物标志物或胚胎条件化治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证类器官的激素反应性蜕膜化
确认单细胞来源的EEOs能够响应激素刺激，重现体内分泌期的蜕膜化特征。
将类器官分别用仅含E2的培养基或E2+P4的培养基处理14天，通过形态学观察和免疫荧光检测SPP1和乙酰化α-微管蛋白的表达。
评估胚胎培养基和胚胎上清液对类器官活力的影响
评估胚胎培养基或胚胎条件上清液对类器官的细胞毒性和增殖的影响，以确保后续共培养实验的可行性。
用不同浓度的COOK胚胎培养基或胚胎上清液处理类器官，通过活/死染色（Calcein AM/EthD-1）检测细胞活力，并用亮场显微镜观察形态和生长情况。
胚胎上清液与蜕膜化类器官共培养
研究来自不同妊娠结局的胚胎分泌组对子宫内膜上皮转录组的影响。
将蜕膜化类器官与个体胚胎的培养上清液共培养24小时，随后提取RNA进行转录组测序和分析。
转录组测序及差异表达分析
鉴定活产组和未妊娠组之间差异表达的基因，并预测其参与的生物学通路。
提取总RNA，构建cDNA文库，进行配对末端RNA-seq，使用DESeq2进行差异表达分析，并进行GO和KEGG功能富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | 356231 |
| 高级DMEM/F12培养基 | Life Technologies | 12634010 | |
| 不含维生素A的B27添加剂 | Life Technologies | 12587010 | |
| N2添加剂 | Life Technologies | 17502048 | |
| 谷氨酰胺补充剂（100X） | Life Technologies | 35050061 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂 | Life Technologies | 41400045 | |
| 重组人Noggin | Peprotech | 120-10c | |
| 重组人FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| 重组人Rspondin-1 | Peprotech | 4645-RS-01M/CF | |
| 重组人EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| bEGF | Peprotech | AF-100-15-100uG | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | A9165-5G | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | |
| 烟酰胺 | Sigma | N0636 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Y-27632 | Abcam | 688000 | |
| β-雌二醇 | Sigma | E4389 | |
| 孕酮 | Sigma | P8783 | |
| 胶原酶V | Sigma-Aldrich | C9263 | |
| DNA酶I | Roche | 11284932001 | |
| TrypLE Express酶 | Thermo Fisher | 12605036 | |
| 细胞回收液 | Corning | 354253 | |
| CryoStor CS-10细胞冷冻保存液 | Sigma-Aldrich | C2874 | |
| HypoThermosol FRS溶液 | Sigma-Aldrich | H4416 | |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| 细胞筛（100μm和40μm） | BD Biosciences | 352340 | |
| 胚胎培养 | COOK序贯培养系统 | COOK Medical | -- |
| 细胞计数 | TC20自动细胞计数仪 | Bio-Rad | 1450102 |
| 显微镜检查 | Leica TCS SP8共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | -- |
| 免疫荧光染色 | 泛细胞角蛋白-Alexa Fluor 488偶联抗体 | Invitrogen/Thermo Fisher | 53-9003-82 |
| E-钙黏蛋白-Alexa Fluor 647偶联抗体 | Biolegend | 147308 | |
| 抗EpCAM抗体 | Cell Signaling Technology | 29295 | |
| 抗SPP1抗体 | Abcam | ab214050 | |
| 抗乙酰化α-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 5335 | |
| 抗小鼠Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | A28175 | |
| 抗兔Alexa Fluor 594二抗 | Invitrogen | A11012 | |
| 细胞活力检测 | 活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒 | Thermo Fisher | L3224 |
| RNA提取 | RNAqueous-Micro总RNA提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AM1912 |
| RNA质量检测 | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| RNA定量 | Qubit RNA HS检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q32852 |
| 文库构建 | SMARTer链特异性总RNA测序试剂盒v3 Pico Input哺乳动物版 | Takara Bio | 634485 |
| 测序 | NovaSeq X Plus测序平台 | Illumina | -- |
| 细胞培养 | 48孔板 | Corning | 3548 |
| 384孔板 | Corning | 3544 | |
| 低吸附吸头 | Eppendorf | 022492062 | |
| 宽口低吸附吸头 | Eppendorf | 022491021 | |
| LoBind低吸附管 | Eppendorf | 0030108442 | |
| 免疫荧光显微镜 | 8孔µ-Slide显微腔室 | ibidi | 80826 |
| 含DAPI封片剂 | Abcam | ab104139 | |
| 细胞活力检测 | 甲醇 | Sigma-Aldrich | 322415 |
| 细胞培养 | Mr Frosty程序降温盒 | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 |
| 组织消化 | MACSMix试管旋转器 | Miltenyi Biotech | -- |
| 组织取样 | Endocell子宫内膜取样器 | Wallach/CooperSurgical | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 类器官建立 | 子宫内膜组织的来源患者年龄和生育史；消化酶浓度和消化时间；类器官培养的Matrigel浓度和体积；培养基成分及浓度。 阅读提示：Materials and methods section 'Establishment of organoids' and 'Organoid generation from single EECs for co-culture' |
| 蜕膜化诱导 | 激素处理方案（E2和P4的浓度及处理时间）；培养时间；培养基更换频率。 阅读提示：Materials and methods section 'Decidualization induction' |
| 胚胎上清液收集 | 胚胎培养条件；收集时间（Day 5）；收集体积；储存条件；胚胎质量等级和妊娠结局定义。 阅读提示：Materials and methods section 'Patient recruitment and embryo culture supernatant collection' |
| 共培养 | 胚胎上清液浓度和体积；共培养时间；使用的类器官代数。 阅读提示：Materials and methods section 'Embryo supernatant–EEO co-culture' |
| RNA-seq分析 | RNA提取试剂盒和步骤；文库构建试剂盒；测序平台；参考基因组；差异表达阈值和统计方法。 阅读提示：Materials and methods section 'RNA isolation and sequencing' and 'RNA-sequencing data analysis' |