多组学单核测序与细胞图谱构建
识别健康与SSc-ILD肺中的细胞类型和染色质状态。
对SSc-ILD和对照肺组织进行scRNA-seq和snATAC-seq，以及多组学snRNA/snATAC-seq，经质量控制后得到67,446个细胞核，聚类为35个细胞簇。
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改变的AP-1、RUNX和EGR染色质动力学驱动人类纤维化肺病
Altered AP-1, RUNX, and EGR chromatin dynamics drive human fibrotic lung disease
实验完整度
高包含多组学单核ATAC/RNA测序、ChromBPNet分析、TF-MoDISco、双荧光素酶报告基因实验、HALO建模、Milo差异丰度分析、RNA velocity等多种证据层级，并进行功能验证。
主要模型
SSc-ILD患者肺组织样本 对照肺组织样本 IMR90人肺成纤维细胞系 THP-1人单核细胞系
重点核对
SSc-ILD与对照肺样本来源（移植肺组织） 多组学单核ATAC/RNA测序的样本量（3 SSc-ILD和2对照用于scRNA/snATAC，6 SSc-ILD和7对照用于多组学） 双荧光素酶报告基因实验中使用的载体（pGL4.26）和细胞系（IMR90和THP-1） TF结合位点突变（点突变破坏TF结合位点） ChromBPNet分析中使用的伪批量ATAC数据（SSc和对照成纤维细胞及SPP1hi巨噬细胞）
摘要
目的：肺纤维化可由自身免疫性、炎症性或特发性疾病引起，包括系统性硬化症相关的间质性肺病（SSc-ILD）。既往研究已 implicating 肌成纤维细胞和 SPP1hi 巨噬细胞作为肺及其他组织纤维化的驱动因素。单细胞RNA测序已描绘了成纤维细胞和巨噬细胞的转录组，但对促纤维化基因程序的转录控制提供了有限的见解。方法：为了确定驱动人类肺纤维化中促纤维化基因程序的染色质可及性动态和转录因子，我们对 explanted 的 SSc-ILD 和对照肺进行了多组学单核ATAC/RNA测序。使用神经网络工具 ChromBPNet，我们分析了伪批量成纤维细胞和巨噬细胞群体，以推断单碱基对分辨率的转录因子结合动态。用于单细胞多组学数据的层次因果建模（HALO），一种新开发的算法，用于推导稀疏多组学数据的低维表示，揭示了转录因子-调控元件-基因网络。结果：ChromBPNet 推断出转录因子与促纤维化基因的结合增加，包括成纤维细胞中的 CTHRC1 和 ADAM12，以及巨噬细胞中的 SPP1 和 CCL18。SSc-ILD 成纤维细胞显示 AP-1、RUNX 和 EGR 转录因子对促纤维化基因的结合和增强子活性增加，而巨噬细胞显示 AP-1 和 bHLH-ZIP 转录因子在调控 SPP1hi 表型的基因中的结合和活性增强。HALO 确认了 AP-1、RUNX 和 EGR 活性控制促纤维化基因程序。结论：这些数据提供了对 SSc-ILD 基因表达程序转录控制复杂性的全面见解，并定义了关键肌成纤维细胞标志基因 CTHRC1 和 ADAM12 中的特定 AP-1、RUNX 和 EGR 增强子，以及 SPP1hi 巨噬细胞中的 bHLH-ZIP 增强子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类肺纤维化（特别是SSc-ILD）中，驱动肌成纤维细胞和SPP1hi巨噬细胞促纤维化基因程序的转录因子结合动态和染色质可及性变化是什么？
- 核心机制
- AP-1、RUNX和EGR转录因子在SSc-ILD成纤维细胞中增强对促纤维化基因（如CTHRC1和ADAM12）的增强子活性，而AP-1和bHLH-ZIP转录因子在SPP1hi巨噬细胞中调控相关基因，共同驱动促纤维化表型。
- 主要证据
- 多组学单核ATAC/RNA测序显示SSc-ILD成纤维细胞中AP-1、RUNX和EGR结合增加；双荧光素酶报告实验验证了CTHRC1、ADAM12、MYO3A、LOXL2和CCL18增强子的TF依赖性；HALO构建的调控网络确认了这些TF与靶基因的关联。
- 研究意义
- 该研究提供了SSc-ILD中转录调控的全面见解，并确定了关键肌成纤维细胞标志基因中的特定增强子，为靶向这些调控元件的治疗策略提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异可及性分析
比较SSc-ILD和对照细胞中的染色质可及性差异。
对每个细胞簇比较SSc和对照的DARs，并注释到基因，进行通路富集分析，确定显著改变的细胞类型，如成纤维细胞和SPP1hi巨噬细胞。
转录因子结合分析
推断转录因子在染色质上的结合动态。
使用ChromBPNet对伪批量ATAC数据进行建模，生成单碱基对分辨率贡献分数，通过TF-MoDISco和JASPAR识别TF结合位点，并比较SSc和对照成纤维细胞及巨噬细胞中的seqlet数量和贡献分数。
增强子活性验证
验证预测的TF结合位点对增强子活性的功能影响。
将包含TF结合位点的OCR克隆到pGL4.26最小启动子载体中，转染IMR90或THP-1细胞，通过双荧光素酶报告基因检测野生型和突变型（点突变破坏TF结合位点）的活性差异。
基因调控网络构建
整合多组学数据构建TF-调控元件-基因网络。
使用HALO推断多组学数据的低维表示，构建metacells，结合独立scRNA-seq数据鉴定DEGs，并在DARs中富集TF基序，构建TF-CRE-gene连接。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建和转染 | pGL4.26 | -- | -- |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 多组学单核测序 | 样本来源和数量：SSc-ILD和对照肺的数量；组织处理方法（消化成单细胞悬液）；测序平台（Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression） 阅读提示：Methods部分 |
| ChromBPNet分析 | 伪批量ATAC数据的构建；训练偏差模型使用的非可及区域；模型参数（未明确） 阅读提示：Methods中ChromBPNet分析部分 |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 载体（pGL4.26）；细胞系（IMR90和THP-1）；突变策略（点突变）；转染方法和时间（未明确）；检测方法（荧光素酶活性比） 阅读提示：Methods中Dual-luciferase reporter assays部分 |
| HALO分析 | 多组学数据（6 SSc, 7对照）和独立scRNA-seq数据（17 SSc, 13对照）；CRE选择距离（250kb）；DEGs筛选标准（abslog2FC > 1） 阅读提示：Methods中Gene regulatory network construction部分 |