差异表达ARGs的筛选与功能富集分析
鉴定OSCC与正常组织之间差异表达的失巢凋亡相关基因，并探索其功能富集
利用TCGA-OSCC数据，通过limma包筛选差异表达ARGs，并进行GO和KEGG富集分析以及PPI网络构建。
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鉴定口腔鳞状细胞癌患者预后相关的失巢凋亡相关基因标签
Identification of an Anoikis-Related Gene Signature to Predict the Prognosis in Patients With Oral Squamous Cell Carcinoma
实验完整度
中包含基于TCGA和GSE41613队列的预后模型构建及生存分析，以及体外细胞功能实验（SPINK1敲低）验证。但缺乏动物模型和体内实验验证。
主要模型
TCGA-OSCC队列 GSE41613队列 SCC-4细胞系 CAL-27细胞系 HOEC细胞系
重点核对
TCGA-OSCC队列包含331例OSCC组织和32例正常组织 GSE41613数据集包含97例HPV阴性OSCC组织 5基因风险评分公式：ARG score = 0.07236405 × SPINK1 + 0.14877518 × PLAU + 0.11810537 × VEGFA + 0.17531494 × PLK1 + 0.06649359 × EGF SCC-4细胞使用siRNA敲低SPINK1（si-SPINK1-1、si-SPINK1-2、si-SPINK1-3） CCK-8检测使用10 μl CCK-8试剂，孵育2小时，检测450 nm吸光度
摘要
背景：失巢凋亡在癌症转移中发挥重要作用。然而，关于失巢凋亡相关基因（ARGs）在口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的预后价值的研究仍然很少。方法：使用TCGA-OSCC队列通过LASSO回归开发了ARG相关基因标签。将TCGA_OSCC和GSE41613数据集中的OSCC患者分为高、低ARG评分（H-score、L-score）组，并分析两组之间的总生存期（OS）。同时，基于TCGA-OSCC队列的数据进行了功能富集、CIBERSORT和药物敏感性分析。采用功能丧失实验探讨SPINK1在OSCC中的生物学作用。结果：在本研究中，我们构建了一个基于5个ARGs（SPINK1、PLAU、VEGFA、PLK1和EGF）的新型OSCC预后模型。H-score组OSCC患者的OS比L-score组差。此外，H-score患者的免疫评分和ESTIMATE评分较低，提示这些患者的免疫状态下降。另外，一些促肿瘤信号通路（如粘着斑、PI3K-Akt和WNT信号通路）在H-score组显著激活。功能上，下调SPINK1显著抑制OSCC细胞活力、迁移和侵袭，并通过失活Nrf2/GPX4信号通路诱导铁死亡。结论：我们开发了一个新的与ARG相关的5基因标签，可以作为OSCC患者OS的预测因子。我们的发现可能为OSCC患者提供个性化治疗的新可能性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 失巢凋亡相关基因在口腔鳞状细胞癌中的预后价值及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- SPINK1通过激活Nrf2/GPX4信号通路抑制铁死亡，从而促进OSCC细胞增殖、迁移和侵袭。
- 主要证据
- 基于TCGA-OSCC和GSE41613队列的LASSO回归和生存分析构建了5基因风险模型；体外实验显示si-SPINK1敲低后Nrf2、GPX4、SLC7A11表达下调，MDA、Fe2+和脂质ROS水平升高，细胞活力、迁移和侵袭能力下降。
- 研究意义
- 该5基因标签可能作为OSCC患者预后的预测因子，为OSCC提供个性化治疗的新可能性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
预后风险模型的构建与验证
构建并验证基于ARGs的预后风险模型，评估其对OSCC患者预后的预测能力
使用TCGA-OSCC队列进行单变量Cox回归和LASSO回归筛选预后相关ARGs，构建风险评分公式，并在TCGA-OSCC和GSE41613队列中进行验证，包括生存分析、PCA和ROC曲线。
免疫浸润和药物敏感性分析
评估风险评分与肿瘤免疫微环境及药物敏感性的关系
通过CIBERSORT评估22种免疫细胞浸润比例，使用estimate包计算免疫和基质评分，并使用oncoPredict包预测药物敏感性。
SPINK1功能实验
验证SPINK1在OSCC细胞中的功能作用及其对铁死亡的影响
在SCC-4细胞中通过siRNA敲低SPINK1，检测细胞活力、迁移、侵袭，并通过Western blot和ELISA检测铁死亡相关指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
构建预后模型
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青链霉素溶液 | -- | -- | |
| 转染 | 小干扰RNA | -- | -- |
| 转染试剂盒（C10511） | RIBOBIO | C10511 | |
| RNA提取 | TriQuick试剂（R1100） | -- | R1100 |
| RT-qPCR | Evo M-MLV RT Mix Kit（含gDNA清除）qPCR Ver.2（AG11728） | -- | AG11728 |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒（AG11701） | -- | AG11701 | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒（CW0014S） | -- | CW0014S |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗VEGFA抗体（19003-1-AP） | -- | 19003-1-AP | |
| 抗PLK1抗体（10305-1-AP） | -- | 10305-1-AP | |
| 抗PLAU抗体（17968-1-AP） | -- | 17968-1-AP | |
| 抗EGF抗体（27141-1-AP） | -- | 27141-1-AP | |
| 抗SPINK1抗体（ab207302） | Abcam | ab207302 | |
| 抗GPX4抗体（67763-1-lg） | -- | 67763-1-lg | |
| 抗Nrf2抗体（16396-1-AP） | -- | 16396-1-AP | |
| 抗SLC7A11抗体（26864-1-AP） | -- | 26864-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体（60004-1-Ig） | -- | 60004-1-Ig | |
| BeyoECL Moon增强化学发光试剂盒（P0018FS） | Beyotime | P0018FS | |
| CCK-8实验 | CCK-8试剂（C0037） | -- | C0037 |
| Transwell迁移/侵袭 | Transwell小室（TCS020024） | -- | TCS020024 |
| 0.1%结晶紫（G1063） | -- | G1063 | |
| Transwell侵袭 | Matrigel基质胶（356234） | BD | 356234 |
| ELISA | MDA检测试剂盒 | -- | -- |
| Fe2+检测试剂盒 | -- | -- | |
| 脂质ROS检测试剂盒 | -- | -- | |
| 测读 | 酶标仪（Infinite F50） | Tecan | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据获取 | TCGA-OSCC队列包含331例OSCC组织和32例正常组织，GSE41613队列包含97例HPV阴性OSCC组织 阅读提示：Methods: Dataset acquisition |
| 差异表达分析 | 筛选标准：Log2(FC)>1，p.adjust<0.05 阅读提示：Methods: Identification of differentially expressed ARGs |
| 预后模型构建 | 单变量Cox回归P<0.01，LASSO回归，5基因评分公式 阅读提示：Methods: Construction of the prognostic risk model |
| 细胞培养 | SCC-4和CAL-27细胞系，培养于含10%FBS和1%青霉素/链霉素的高糖DMEM，5%CO2，37°C 阅读提示：Methods: Cell culture and transfection |
| SPINK1敲低 | siRNA转染（si-SPINK1-1、si-SPINK1-2、si-SPINK1-3） 阅读提示：Methods: Cell culture and transfection |
| CCK-8实验 | 细胞种96孔板，10μl CCK-8试剂孵育2小时，检测450nm吸光度 阅读提示：Methods: Cell counting kit-8 assay |
| Transwell迁移/侵袭 | 上室1×10^4细胞，0.1%FBS，下室10%FBS，24小时；侵袭实验需预包被Matrigel 阅读提示：Methods: Transwell migration and invasion assays |