原纤维提取
从两种AD小鼠模型中提取Aβ原纤维用于结构分析。
采用sarkosyl提取法对5xFAD和AppNL-FPsen1P117L小鼠脑组织进行原纤维提取，获得可溶性原纤维。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
通过冷冻电镜揭示5xFAD和AppNL-FPsen1P117L小鼠中Aβ病理的分子保真度
The molecular fidelity of Aβ pathology in 5xFAD and AppNL-FPsen1P117L mice revealed by cryo-EM
实验完整度
中实验包含从两种小鼠脑组织中提取原纤维并进行冷冻电镜结构解析，但主要集中在结构验证层面，缺少功能性和机制性验证实验。
主要模型
5xFAD小鼠 AppNL-FPsen1P117L小鼠
重点核对
小鼠品系和基因型：5xFAD杂合小鼠，AppNL-FPsen1P117L纯合小鼠 小鼠年龄和性别：5xFAD为10月龄雌性，AppNL-FPsen1P117L为14月龄雄性 原纤维提取方法：sarkosyl提取法，使用400 mg脑组织，缓冲液含10 mM Tris-HCl pH7.5、800 mM NaCl、10%蔗糖、1 mM EGTA 冷冻电镜数据采集参数：300 kV，总剂量40 e-/Å2，像素大小0.932 Å/像素 模型构建参考：人类II型Aβ原纤维结构（PDB 7Q4M）作为初始模型
摘要
动物模型，尤其是小鼠模型，对于理解阿尔茨海默病（AD）的发病机制以及开发治疗和诊断药物不可或缺。虽然大多数AD小鼠模型旨在模拟大脑中的淀粉样β（Aβ）病理，但先前的研究表明，并非所有模型都能重现AD患者大脑中观察到的Aβ原纤维结构。在本研究中，我们确定了从两种AD模型5xFAD和AppNL−FPsen1P117L的大脑中提取的Aβ原纤维的冷冻电镜（cryo-EM）结构。前者代表了最广泛使用的转基因AD模型之一，而后者是第三代敲入模型，旨在解决传统模型中APP过表达引起的问题。我们的结果显示，来自5xFAD小鼠的原纤维表现出与AD患者中发现的几乎相同的人II型Aβ原纤维结构，而AppNL−FPsen1P117L小鼠主要含有II型Aβ原纤维，但也包含另一种Aβ原纤维种类。在所有已报道的人和小鼠II型结构中，注意到在Val36位置的主链排列存在细微差异，这可能源于人脑和小鼠脑微环境的差异。总之，我们的研究结果验证了5xFAD和AppNL−FPsen1P117L小鼠中Aβ病理的复制，并为需要在分子水平上复制Aβ结构的研究选择适当的动物模型提供了额外选项。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 5xFAD和AppNL-FPsen1P117L小鼠模型是否能准确复制人类AD患者大脑中的Aβ原纤维结构？
- 核心机制
- 5xFAD和AppNL-FPsen1P117L小鼠中的Aβ原纤维主要采用人类II型Aβ原纤维折叠，其中AppNL-FPsen1P117L小鼠还包含一种II型样原纤维亚种。人类和小鼠II型原纤维在Val36处主链方向存在差异，影响Lys28与Ala42之间的盐桥形成，但该差异不显著影响配体结合特异性。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构解析显示，5xFAD小鼠原纤维（分辨率3.5 Å）和AppNL-FPsen1P117L小鼠主要原纤维种类（3.2 Å）与人类II型Aβ原纤维几乎相同，次要种类（3.4 Å）呈II型样结构。
- 研究意义
- 研究验证了5xFAD和AppNL-FPsen1P117L模型在分子水平上复制Aβ病理的能力，为AD研究和靶向Aβ的药物或示踪剂的临床前研究提供了额外的模型选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
冷冻电镜数据采集
收集原纤维的冷冻电镜图像以进行三维结构解析。
将原纤维样品应用于Quantifoil铜网，使用Titan Krios G3i显微镜和Falcon 4i探测器采集图像。
螺旋重构和三维分类
确定原纤维的对称性和螺旋参数，并分类不同的原纤维形态。
使用RELION 4.0进行运动校正和CTF估计，采用Topaz自动拾取颗粒，进行二维分类和三维分类。
结构解析和模型构建
解析原纤维的原子模型并验证其Aβ身份。
以人类II型Aβ原纤维结构（PDB 7Q4M）为初始模型，进行刚体拟合，使用COOT手动修改，并用phenix.real_space_refine精修。
结构比较
比较不同小鼠模型和人类中的Aβ原纤维结构，评估模型保真度。
将5xFAD和AppNL-FPsen1P117L的原纤维结构与人类II型（PDB 7Q4M）及其他小鼠模型（APP23, ARTE10, tg-APPSwe等）的结构进行比对。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 冷冻电镜样品制备 | Quantifoil 1.2/1.3, 200目 | -- | -- |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 冷冻电镜数据采集 | FEI Titan Krios G3i | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Falcon 4i | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠品系与年龄 | 5xFAD为杂合小鼠（C57BL/6J背景，雌性，10月龄）；AppNL-FPsen1P117L为纯合小鼠（雄性，14月龄） 阅读提示：见Methods '5xFAD and AppNL−FPsen1P117L mice' |
| 原纤维提取 | 提取缓冲液成分、sarkosyl浓度、离心速度和时间 阅读提示：见Methods 'Fibril extraction' |
| 冷冻电镜数据采集 | 电压（300 kV）、剂量（40 e-/Å2）、像素大小（0.932 Å/像素） 阅读提示：见Methods 'Cryo-EM data collection and processing' |
| 结构解析 | 对称性（C2或2-start螺旋）、螺旋参数（上升和扭转） 阅读提示：见Methods 'Cryo-EM data collection and processing' 和 Table 1 |
| 模型构建 | 初始模型（PDB 7Q4M）、建模范围（残基12-42或9-42） 阅读提示：见Methods 'Atomic model Building' |