KMT2D缺失对AR依赖性前列腺癌染色质和转录的影响
评估KMT2D在AR依赖性前列腺癌中调控AR转录的机制
在LNCaP细胞中敲低KMT2D，结合PI3K抑制剂（GDC0941）和DHT处理，通过ATAC-seq、ChIP-seq、RNA-seq分析染色质可及性、AR/FOXA1/H3K4me1结合及基因表达变化，并进行增殖实验。
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组蛋白甲基转移酶KMT2D是去势抵抗性前列腺癌谱系可塑性和治疗反应的关键介导因子
The Histone Methyltransferase KMT2D is a Critical Mediator of Lineage Plasticity and Therapeutic Response in Castration Resistant Prostate Cancer
实验完整度
高包含细胞系、患者来源类器官、异种移植模型和患者样本等多个独立证据层级，并涉及功能验证和机制验证。
主要模型
LNCaP细胞系（AR依赖性，PTEN缺失） MSKPCA3/ MSKPCA12患者来源类器官（CRPC-SCL，AR低） DU145和PC3细胞系（CRPC-SCL，AR阴性） PC3异种移植模型
重点核对
KMT2D敲低方式（shRNA或doxycycline诱导）及敲低效率 PI3K/AKT抑制剂（GDC0941、capivasertib等）的浓度和处理时间 AR和FOXA1的染色质结合检测（ChIP-seq, ChIP-qPCR） AP-1和YAP/TAZ靶基因的表达变化（RNA-seq, RT-qPCR） 体内实验中shKMT2D的doxycycline诱导及相关给药方案
摘要
去势抵抗性前列腺癌（CRPC）的生长很大程度上依赖于雄激素受体（AR），并且经常表现出过度活跃的PI3K信号，最常见的原因是PTEN缺失。抗AR疗法的治疗压力可诱导向不依赖AR表型的转分化。最近，AR非依赖性CRPC的不同亚型被重新定义，其中干细胞样（SCL）亚型成为最常见的亚型之一。阐明控制这些不同CRPC细胞状态维持的表观遗传机制，可能为CRPC的有效联合疗法铺平道路。在本研究中，我们确定了组蛋白甲基转移酶KMT2D在建立染色质能力方面的关键作用，该能力对于AR依赖性CRPC细胞系、患者来源的类器官和患者样本中AR和FOXA1转录因子（TF）的招募以及AR转录输出至关重要。出乎意料的是，KMT2D维持了AR低表达的CRPC-SCL亚型的身份，并控制了AP-1转录因子（如FOSL1）的活性，FOSL1是该亚型的主调控因子。单细胞转录组学和染色质分析强调了KMT2D通过AP-1和FOXA1维持混合谱系细胞状态的作用。在CRPC-AR和CRPC-SCL亚型中，PI3K/AKT和KMT2D的联合抑制降低了前列腺癌细胞和患者来源类器官的细胞增殖。总之，这些结果揭示了KMT2D是亚型特异性CRPC表观遗传景观的主要介导因子，有助于肿瘤生长和治疗反应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 组蛋白甲基转移酶KMT2D在AR依赖性和AR非依赖性（CRPC-SCL）前列腺癌中如何调控染色质可及性和转录程序，并影响肿瘤生长和治疗反应？
- 核心机制
- KMT2D通过建立染色质能力，促进AR和FOXA1在AR依赖性CRPC中结合；在CRPC-SCL中，KMT2D维持AP-1（如FOSL1）依赖的混合谱系状态。
- 主要证据
- 在LNCaP细胞中，KMT2D敲低导致AR/FOXA1结合减少、H3K4me1/2降低、增殖下降；在MSKPCA3/DU145/PC3中，KMT2D敲低破坏AP-1/FOXA1靶基因表达，单细胞多组学显示混合谱系标志丧失，体内实验中KMT2D敲低增强capivasertib的抗肿瘤作用。
- 研究意义
- KMT2D是CRPC中AR依赖性和AR非依赖性亚型的关键表观遗传调控因子，为联合靶向KMT2D和PI3K/AKT通路治疗CRPC提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
KMT2D对CRPC-SCL中染色质可及性和AP-1/FOXA1程序的调控
探究KMT2D在AR低/PTEN缺失的CRPC-SCL模型中维持细胞状态的作用
在MSKPCA3类器官、DU145和PC3细胞中敲低KMT2D，通过ATAC-seq、RNA-seq和FOSL1 ChIP-seq分析染色质可及性、转录组和TF结合变化。
单细胞多组学分析KMT2D维持CRPC-SCL混合谱系状态
在单细胞水平上确定KMT2D缺失对CRPC-SCL细胞状态和转录因子活性的影响
对KMT2D敲低和对照MSKPCA3类器官进行单细胞多组学（scRNA-seq + scATAC-seq），分析细胞聚类、谱系标志物和转录因子活性。
评估KMT2D敲低与PI3K/AKT抑制联合的体内外抗肿瘤效果
验证KMT2D抑制联合PI3K/AKT抑制剂的潜在治疗价值
在PC3细胞和类器官中，结合KMT2D敲低和GDC0941/capivasertib处理进行增殖实验；在PC3异种移植模型中，结合doxycycline诱导的shKMT2D和capivasertib治疗，测量肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Corning | -- |
| DMEM培养基 | Corning | -- | |
| 多聚赖氨酸 | sigma | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 类器官培养 | II型胶原酶 | Gibco | -- |
| advanced DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| TrypLE消化液 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 卡帕塞替尼 | Selleckchem | -- |
| GDC0941 | -- | -- | |
| 恩扎卢胺 | -- | -- | |
| 多西环素 | -- | -- | |
| 双氢睾酮 | -- | -- | |
| GDC0068 | -- | -- | |
| MK2206 | -- | -- | |
| AZD6482 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞增殖检测 | Prestoblue细胞活力试剂 | Thermofisher | -- |
| Cell Titer Glo试剂 | Promega | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | ThermoFisher | -- | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoScientific | -- | |
| NuPAGE 3-8% bis-tris梯度预制胶 | Invitrogen | -- | |
| tris-acetate SDS电泳缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 4-12% bis-tris梯度预制胶 | Invitrogen | -- | |
| MOPS SDS电泳缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | 抗V5琼脂糖凝胶抗体 | Sigma Aldrich | A7345 |
| 免疫印迹 | 抗KMT2D抗体 | Fortis LifeSciences | A300-BL1185 |
| 磷酸化KMT2D (S1331)抗体 | Eurogentec | Custom | |
| 抗AR [D6F11] XP抗体 | Cell Signaling Technology | 5153 | |
| 抗FOXA1 [E7E8W]抗体 | Cell Signaling Technology | 53528 | |
| 抗FOXA2抗体 | Proteintech | 22474-1-AP | |
| 抗V5 [D3H8Q]抗体 | Cell Signaling Technology | 13202 | |
| 抗突触素 [YE269]抗体 | Abcam | ab32127 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| 抗纽蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4650 | |
| 组蛋白H3（单甲基K4）抗体 | Abcam | ab8895 | |
| 组蛋白H3 [D2B12]抗体 | Cell Signaling Technology | 4620 | |
| 抗角蛋白5抗体 | BioLegend | 905504 | |
| 纯化的抗角蛋白8抗体 | BioLegend | 904801 | |
| 抗波形蛋白 [D21H3] XP抗体 | Cell Signaling Technology | 5741 | |
| ECL抗兔IgG HRP偶联抗体 | -- | NA934V | |
| 抗鼠IgG HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 免疫组织化学/免疫荧光 | Ventana Discovery Ultra自动染色仪 | Ventana | -- |
| DAB显色液 | -- | -- | |
| 苏木素 | -- | -- | |
| DAPI染色液 | Carl Roth | 6843.2 | |
| RNA提取 | Qiagen RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| RT-qPCR | SYBR Select预混液 | Applied Biosystems | -- |
| ViiA 7实时荧光定量PCR系统 | -- | -- | |
| 组蛋白提取 | Triton X-100 | -- | -- |
| ChIP-seq | 雄激素受体抗体 [ER179(2)] | Abcam | ab108341 |
| FOXA1抗体（ChIP级） | Abcam | ab23738 | |
| KMT2D抗体 | Sigma-Aldrich | HPA035977 | |
| 组蛋白H3（二甲基K4）抗体 [Y47] | Abcam | ab32356 | |
| FRA1/FOSL1 [D80B4]抗体 | Cell Signaling Technology | 5281 | |
| ChIP-qPCR | 兔IgG对照 | Abcam | ab171870 |
| ATAC-seq | Accutase消化液 | Stemcell technologies | -- |
| CUT&RUN | Epicypher CUTANA CUT&RUN v3试剂盒 | Epicypher | -- |
| H3K4me1抗体 | Epicypher | 13-0057 | |
| 单细胞多组学 | Chromium Next GEM单细胞多组学试剂盒A | 10x Genomics | 1000282 |
| ATAC试剂盒A | 10x Genomics | 1000280 | |
| 稀释核缓冲液 | 10x Genomics | PN-2000207 | |
| Countess II自动细胞计数器 | -- | -- | |
| 测序 | Illumina HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 动物实验 | 多西环素诱导饲料 | VWR | -- |
| 对照饲料 | VWR | -- | |
| NSG雄性小鼠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基、血清和抗生素浓度、培养条件（温度、CO2） 阅读提示：Materials and Methods：Experimental models - Cell lines |
| 类器官培养 | 类器官系（MSKPCA2/3/12等）、基质胶、培养基组成、传代方法 阅读提示：Materials and Methods：Experimental models - Prostate organoids |
| KMT2D敲低 | shRNA序列或载体、诱导型系统（doxycycline浓度）、处理时间 阅读提示：Materials and Methods：Experimental Methods - Lentiviral production |
| 药物处理 | 药物名称、浓度、溶剂、处理时间（GDC0941、capivasertib等） 阅读提示：Materials and Methods：Experimental Methods - In vitro proliferation assays |
| 染色质分析 | 细胞处理条件、抗体、建库方法、测序平台、数据分析参数 阅读提示：Materials and Methods：Experimental Methods - Bulk RNA-seq, ChIP-seq, ATAC-seq in LNCaP cells |
| 单细胞多组学 | 细胞数量、转座反应条件、测序平台、数据分析流程 阅读提示：Materials and Methods：Experimental Methods - Single-cell multiome library prep and sequencing |
| 体内实验 | 小鼠品系、细胞数量、注射方式、给药剂量和频率、肿瘤测量时间、实验时长 阅读提示：Materials and Methods：Experimental models - Cell-derived xenograft studies |