体外细胞增殖抑制实验
评估FT671对NRAS突变黑色素瘤细胞系增殖的抑制作用。
用不同浓度FT671处理多种黑色素瘤细胞系5天，测定IC50。
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选择性USP7抑制与MEK1/2抑制剂协同增强免疫反应并增强抗PD-1治疗在NRAS突变黑色素瘤中的疗效
Selective USP7 Inhibition Synergizes with MEK1/2 Inhibitor to Enhance Immune Responses and Potentiate Anti-PD-1 Therapy in NRAS-Mutant Melanoma
实验完整度
高包含体外细胞系筛选、CRISPR筛选与敲除验证、RPPA分析、同系移植模型、免疫表型分析及联合用药体内实验，涵盖分子机制、细胞功能与体内药效等多个独立证据层级。
主要模型
NRAS突变黑色素瘤细胞系（如WM1361A、SBcl2） Nras突变小鼠黑色素瘤同系移植模型（M173M1、1007）
重点核对
FT671浓度（IC50测定，5天处理） USP7敲除及回补（野生型与C223S突变体）对细胞增殖的影响 TP53、TP53BP1、CDKN1A敲除对FT671敏感性的影响 FT671和trametinib联合处理的浓度（FT671 3μmol/L、trametinib 3nmol/L） 体内给药剂量（FT671 100mg/kg/d，trametinib 0.2mg/kg/d）和给药方式（口服灌胃）
摘要
针对NRAS突变黑色素瘤的靶向治疗仍然是一个未满足的临床需求。我们发现，用选择性USP7抑制剂（USP7i）FT671抑制泛素特异性肽酶7（USP7）可抑制NRAS突变黑色素瘤细胞系的增殖。此外，我们鉴定并验证了TP53BP1、TP53或CDKN1A的敲除赋予了对FT671的耐药性，表明功能性p53信号通路的激活对于USP7i的疗效至关重要。在Nras突变黑色素瘤同系移植模型中，FT671治疗延缓了肿瘤生长。此外，FT671与MEK1/2抑制剂（MEKi）的联合治疗在体外具有协同作用并诱导细胞焦亡。在免疫competent小鼠中，联合治疗显著抑制肿瘤生长，延长生存期，并增强瘤内免疫细胞浸润，特别是增加CD8⁺T细胞和成熟树突状细胞的比例，表明抗肿瘤免疫被激活。值得注意的是，USP7i、MEKi和抗PD-1抗体的三联组合导致持久的肿瘤消退，效果在治疗停止后持续超过80天。这些发现确立了USP7i+MEKi作为一种有前景的策略来靶向NRAS这一黑色素瘤中“不可成药”的突变，并为临床开发USP7i加MEKi作为辅助治疗以增强NRAS突变黑色素瘤患者抗PD-1免疫治疗提供了强有力的理论依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 选择性USP7抑制在NRAS突变黑色素瘤中的疗效及其与MEK1/2抑制剂联合应用能否增强抗肿瘤免疫和抗PD-1治疗的效果？
- 核心机制
- USP7抑制通过激活p53信号通路（TP53BP1-TP53-CDKN1A轴）抑制肿瘤细胞增殖；与MEK1/2抑制剂联合可诱导细胞焦亡，增强抗肿瘤免疫，并提高抗PD-1治疗的响应。
- 主要证据
- 体外细胞系实验显示FT671抑制NRAS突变细胞增殖，敲除TP53、TP53BP1、CDKN1A导致耐药；同系移植模型中联合治疗显著抑制肿瘤生长并延长生存，免疫分析显示CD8⁺T细胞和成熟树突状细胞比例增加；三联组合（USP7i+MEKi+抗PD-1）实现持久肿瘤消退。
- 研究意义
- 该研究为NRAS突变黑色素瘤提供了一种新的治疗策略，支持USP7i联合MEKi作为辅助治疗以增强抗PD-1免疫治疗的临床开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
USP7敲除和回补实验
验证FT671的效应是否依赖于USP7及其催化活性。
在WM1361A-iCas9细胞中通过CRISPR敲除USP7，并回补野生型或催化失活突变体，观察细胞生长。
全基因组CRISPR筛选
鉴定FT671耐药相关的基因。
用sgRNA文库转导WM1361A-iCas9细胞，用DMSO或FT671处理7天，比较sgRNA富集情况。
基因敲除验证
验证筛选出的候选基因敲除是否影响FT671敏感性。
分别敲除TP53、TP53BP1、CDKN1A等基因，用不同浓度FT671处理5天，测定细胞活力。
RPPA分析
分析FT671处理对蛋白表达和磷酸化的影响。
用DMSO或FT671处理WM1361A和WM1366细胞，提取蛋白进行RPPA分析。
体内药效实验（同系移植模型）
评估FT671单药及联合治疗在体内的抗肿瘤效果。
将Nras突变小鼠黑色素瘤细胞（M173M1、1007）接种到C57BL/6J小鼠，待肿瘤体积达到100mm³后随机分组，给予FT671、trametinib或联合治疗，监测肿瘤生长和生存期。
免疫细胞浸润分析
检测联合治疗对肿瘤免疫微环境的影响。
治疗7天后取肿瘤，制备单细胞悬液，流式细胞术分析免疫细胞亚群。
三联组合治疗实验
评估USP7i+MEKi联合抗PD-1抗体的抗肿瘤效果。
M173M1荷瘤小鼠分为四组，接受溶剂+对照抗体、联合+对照抗体、溶剂+抗PD-1、联合+抗PD-1治疗，监测肿瘤生长和生存。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞培养和药物处理
分子表达分析
细胞死亡和周期分析
体内药效评估
免疫分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MCDB153培养基 | Sigma | -- |
| Leibowitz L-15培养基 | -- | -- | |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| Opti-MEM培养基 | -- | -- | |
| Ham's F12培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 药物处理 | FT671 | MedChemExpress | HY-107985 |
| 曲美替尼 | Selleck Chem | S2673 | |
| PD0325901 | -- | -- | |
| P5091 | -- | -- | |
| HBX41108 | -- | -- | |
| 抗体治疗 | 抗PD-1抗体（克隆RMP1-14） | Bio X Cell | BE0146 |
| 同型对照抗体 | Bio X Cell | BE0089 | |
| CRISPR筛选 | Guide-it CRISPR全基因组文库PCR试剂盒 | Takara Bio | 632646 |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11836170001 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | 4906845001 | |
| Laemmli样品缓冲液 | Bio-Rad | 1610747 | |
| 双色预染蛋白marker II | Nantong Broth Biotechnology Co., Ltd. | PM201 | |
| 抗Vinculin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-73614 | |
| 抗p53抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-126 | |
| 抗β-actin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 抗USP7抗体 | Cell Signaling Technology | 4833 | |
| 抗DNMT1抗体 | Cell Signaling Technology | 5032 | |
| 抗TP53BP1抗体 | Cell Signaling Technology | 88439 | |
| 抗NF2抗体 | Cell Signaling Technology | 12888 | |
| 抗KHSRP抗体 | Cell Signaling Technology | 13398 | |
| 抗MDM2抗体 | Cell Signaling Technology | 86934 | |
| 抗MITF抗体 | Cell Signaling Technology | 12590 | |
| 抗PUMA抗体 | Cell Signaling Technology | 12450 | |
| 抗p21抗体 | Cell Signaling Technology | 2946 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4696 | |
| 抗磷酸化S6 (S240/244)抗体 | Cell Signaling Technology | 2215 | |
| 抗磷酸化S6 (S235/236)抗体 | Cell Signaling Technology | 4857 | |
| 抗S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| 抗caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| 抗HMGB1抗体 | Cell Signaling Technology | 6893 | |
| 抗GSDME抗体 | Abcam | ab215191 | |
| 细胞凋亡检测 | FITC Annexin V凋亡检测试剂盒 | BD Pharmingen | 556547 |
| 细胞周期检测 | RNase I | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | DAPI | BD | 564907 |
| TruStain FcX PLUS | BioLegend | 156603 | |
| Lymphoprep | STEMCELL Technologies | -- | |
| 小鼠肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | |
| gentleMACS解离器及C管 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 流式抗体（CD45.2、CD3、CD4、CD8α、CD25、PD-1、NK1.1、CD11b、CD11c、CD80、CD163、I-A/I-E、CD86、CD206、PD-L1） | BioLegend | -- | |
| 细胞培养 | Matrigel基质胶 | Corning | 354248 |
| 细胞计数 | BECKMAN Coulter Vi-CELL XR细胞活力分析仪 | BECKMAN Coulter | -- |
| 细胞活力监测 | IncuCyte活细胞成像系统 | Essen Bioscience | -- |
| 流式分析 | BD Celesta流式细胞仪 | BD | -- |
| BD FACSAria II流式细胞仪 | BD | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系处理 | 细胞系来源和培养条件：不同细胞系（WM1361A、SBcl2等）的培养基和血清浓度；FT671处理浓度和时间（如IC50测定用浓度梯度处理5天）。 阅读提示：详见Methods中的“Cell culture and drug treatment in vitro”及图1图注 |
| 注射剂量与途径 | 动物模型：C57BL/6J小鼠，皮下注射M173M1或1007细胞数量（5×10^6或1×10^6）；FT671给药剂量100mg/kg/d，口服灌胃；trametinib剂量0.2mg/kg/d。 阅读提示：详见Methods中的“In vivo tumor growth studies”及图3、图5、图6图注 |
| 治疗时间节点 | 治疗起始时间：肿瘤体积达到100mm³或200mm³；治疗持续时间：如图5中74天，图6中80天后停止；免疫分析前治疗7天。 阅读提示：详见Methods中的“In vivo tumor growth studies”及图5、图6图注 |
| 抗PD-1抗体给药方案 | 抗PD-1抗体（clone RMP1-14）剂量5mg/kg，腹腔注射，给药时间点（第0、3、9、12、18、21、27、30天）。 阅读提示：详见Methods中的“In vivo tumor growth studies”及图6图注 |
| 统计与重复 | 体外实验至少三个生物学重复；统计检验方法（如two-way ANOVA、log-rank test）及显著性阈值（p<0.05）需核对原文。 阅读提示：详见Methods中的“Statistical analysis and reproducibility”及各图注中的统计说明 |