建立肥胖小鼠模型并评估疼痛行为
验证高脂饮食诱导的肥胖小鼠是否表现出疼痛超敏反应。
C57BL/6J小鼠饲喂高脂饮食（60% kcal脂肪）20周建立DIO模型，对照组饲喂正常饮食。通过von Frey、Hargreaves和CPA测试评估机械痛阈、热痛阈和疼痛厌恶。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
丘脑室旁核中的CXCL7/CXCR2介导肥胖相关疼痛
CXCL7/CXCR2 in the paraventricular thalamus mediates obesity-related pain
实验完整度
高包含行为学、化学遗传学、光纤记录、脑片电生理、病毒示踪、蛋白质组学及临床样本分析等多个独立证据层级，并进行功能验证与机制验证。
主要模型
饮食诱导肥胖（DIO）小鼠模型 C57BL/6J小鼠 CXCR2flox小鼠 肥胖患者及健康对照血浆样本
重点核对
小鼠模型：C57BL/6J小鼠，高脂饮食（60% kcal脂肪）喂养20周诱导DIO 病毒注射：AAV-CaMKII-hM4Di-mCherry（PT-0050）等注入PVT或BLA，注射体积100-300 nl，速率30 nl/min 行为学检测：von Frey、Hargreaves、CPA测试，CNO腹腔注射（5 mg/kg，实验前30 min） 电生理记录：脑片全细胞记录，电流阶跃0-160 pA（PVT）或0-200 pA（BLA）
摘要
高脂饮食是驱动全球肥胖流行的主要因素，因此构成了重大的公共卫生挑战。先前的研究表明，肥胖个体表现出更高的疼痛相关疾病患病率。然而，其潜在的神经机制在很大程度上仍不清楚。在此，我们确定了丘脑室旁核（PVTGlu）中的谷氨酸能神经元参与肥胖相关疼痛。抑制PVTGlu神经元可逆转肥胖小鼠的疼痛超敏反应。对肥胖患者血浆样本的蛋白质组学分析显示，趋化因子（C-X-C基序）配体7（CXCL7）水平显著升高。将CXCL7输注到PVT中增加了PVTGlu神经元的兴奋性，并在对照小鼠中诱发了疼痛超敏反应。此外，在肥胖小鼠的PVTGlu神经元中观察到CXC趋化因子受体2（CXCR2）表达增加。敲低PVTGlu神经元中的CXCR2受体可降低PVTGlu神经元的兴奋性并缓解肥胖小鼠的疼痛超敏反应。此外，PVTGlu神经元向基底外侧杏仁核中的谷氨酸能神经元（BLAGlu）发送兴奋性输入，这对于肥胖相关疼痛是必需的。我们的研究表明，下调PVTGlu神经元中的CXCR2受体可消除BLAGlu神经元活动的升高，同时缓解肥胖小鼠的疼痛超敏反应。总之，这些发现强调了CXCL7-CXCR2轴增强PVTGlu→BLAGlu通路在肥胖相关疼痛超敏反应中的关键作用，为针对肥胖相关疼痛的治疗策略的开发提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肥胖相关疼痛的神经机制，特别是丘脑室旁核（PVT）及其下游通路的作用。
- 核心机制
- CXCL7-CXCR2轴增强PVTGlu→BLAGlu通路活性，导致疼痛超敏反应。
- 主要证据
- 行为学测试显示DIO小鼠痛觉超敏；化学遗传学抑制PVTGlu或BLAGlu神经元缓解疼痛；CXCL7输注增加PVTGlu神经元兴奋性并诱发疼痛；CXCR2敲低降低PVTGlu和BLAGlu神经元活性并缓解疼痛；病毒示踪和电生理证实PVTGlu→BLAGlu兴奋性投射。
- 研究意义
- 为肥胖相关疼痛的治疗策略提供新的见解和潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测PVT神经元活性
确定PVT区域神经元在疼痛刺激下是否被激活。
通过c-Fos免疫荧光染色检测疼痛刺激后PVT区域神经元激活情况，并分析与CaMKII的共标率。
化学遗传学调控PVTGlu神经元
验证PVTGlu神经元活性对疼痛行为的影响。
在DIO小鼠PVT注射AAV-CaMKII-hM4Di-mCherry进行抑制性调控，在对照小鼠注射AAV-CaMKII-hM3Dq-mCherry进行激活，腹腔注射CNO后评估行为。
血浆蛋白质组学分析
筛选肥胖相关疼痛的候选分子。
对肥胖患者和健康对照血浆进行LC-MS/MS蛋白质组学分析，通过PCA、GO、KEGG和IPA分析差异蛋白。
验证CXCL7在PVT的作用
研究CXCL7对PVTGlu神经元活性和疼痛行为的影响。
向对照小鼠侧脑室或PVT内输注重组CXCL7蛋白，通过免疫荧光、电生理和行为学检测其效应。
敲低CXCR2受体
验证CXCR2受体在PVTGlu神经元中的作用。
在DIO CXCR2flox小鼠PVT注射AAV-CaMKII-Cre-mCherry敲低CXCR2，通过免疫荧光、电生理、光纤记录和行为学评估效果。
示踪PVTGlu→BLAGlu通路
证实PVTGlu神经元向BLA的投射及细胞类型。
采用顺行和逆行示踪病毒结合免疫荧光染色，验证PVT→BLA投射的神经元类型，并通过光遗传和电生理验证功能性突触连接。
评估BLAGlu神经元活性
确认BLAGlu神经元活性是否参与肥胖相关疼痛。
通过电生理记录和光纤记录检测DIO小鼠BLAGlu神经元活性，并通过化学遗传学抑制验证其对疼痛行为的影响。
调控PVTGlu→BLAGlu通路
验证该通路在肥胖相关疼痛中的因果作用。
通过在PVT和BLA注射病毒进行化学遗传学抑制，检测BLAGlu神经元活性和行为变化。
验证CXCR2对通路的作用
验证CXCR2敲低能否通过影响PVTGlu→BLAGlu通路缓解疼痛。
在DIO CXCR2flox小鼠或C57小鼠中，通过病毒介导的CXCR2敲低，检测BLAGlu神经元活性和行为变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物饲养 | C57BL/6J小鼠 | GemPharmatech | N000295 |
| C57BL/6Smoc-Cxcr2em1(flox)Smoc小鼠 | Shanghai Model Organisms Center | NM-CKO-210198 | |
| 高脂饮食（60% kcal脂肪） | Medicience | MD12033 | |
| 行为学测试 | 冯弗雷纤维丝 | RWD | -- |
| 哈格里夫斯装置 | IITC | -- | |
| Smart 3.0系统 | -- | -- | |
| 组织染色 | 冰冻切片机（Leica CM1860） | Leica | -- |
| 显微镜（VS200） | Olympus | -- | |
| 立体定位注射 | 立体定位仪 | RWD | -- |
| 化学遗传学 | 氯氮平-N-氧化物 | BrainVTA | -- |
| 病毒注射 | AAV-CaMKII-hM4Di-mCherry | BrainVTA | PT-0050 |
| AAV-CaMKII-hM3Dq-mCherry | BrainVTA | PT-0049 | |
| Retro-AAV-Cre | BrainVTA | PT-0136 | |
| AAV-DIO-hM4Di-mCherry | BrainVTA | PT-0020 | |
| AAV-CaMKII-mCherry | BrainVTA | PT-0108 | |
| AAV-DIO-mCherry | BrainVTA | PT-0115 | |
| AAV-CaMKII-Cre-mCherry | -- | -- | |
| AAV-DIO-shRNA(CXCR2) | BrainVTA | -- | |
| AAV-DIO-shRNA(scramble) | BrainVTA | -- | |
| AAV-CaMKII-ChR2-mCherry | BrainVTA | PT-0297 | |
| AAV-hSyn-Cre-EGFP | BrainVTA | PT-1168 | |
| AAV-DIO-EGFP | BrainVTA | PT-0795 | |
| Retro-AAV-hSyn-EGFP | BrainVTA | PT-0290 | |
| AAV-CaMKII-GCaMP6s | BrainVTA | PT-0110 | |
| 光纤记录 | 光纤 | Inper | -- |
| 多通道光纤记录系统 | Inper | Inper-C1-3 C | |
| Inper数据处理软件 | Inper | -- | |
| 药理实验 | CXCL7蛋白 | MCE | HY-P75698 |
| 导管 | RWD | -- | |
| 免疫荧光 | 抗CaMKII抗体（兔） | Abcam | ab134041 |
| 抗CaMKII抗体（小鼠） | Abcam | ab171095 | |
| 抗CXCL7抗体 | Abcam | ab251455 | |
| 抗CXCR2抗体 | Proteintech | 20634-1-AP | |
| 抗CXCR1抗体 | ThermoFisher | PA1-29466 | |
| 抗GPX4抗体 | Santa Cruz | sc166437 | |
| 抗IBA1抗体 | Abcam | ab178846 | |
| 抗c-Fos抗体 | Santa Cruz | sc-8047 | |
| 含DAPI的抗淬灭封片剂 | -- | -- | |
| 共聚焦显微镜（LSM900） | Carl Zeiss | -- | |
| 免疫荧光定量 | ImageJ软件 | -- | -- |
| RNA FISH | RNA荧光原位杂交试剂盒 | Genepharma | F40173 |
| 微胶质细胞分析 | IMARIS软件 | Bitplane | -- |
| 电生理 | 振动切片机（7000SMZ-2） | Campden | -- |
| 正置显微镜（Eclipse FN1） | Nikon | -- | |
| 微电极拉制仪（P1000） | Sutter Instrument | -- | |
| MultiClamp 700B放大器 | Molecular Devices | -- | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | -- | |
| pCLAMP 10.3软件 | Molecular Devices | -- | |
| Clampfit 10软件 | Molecular Devices | -- | |
| 蛋白质组学 | timsTOF Pro质谱仪 | Bruker | -- |
| Spectronaut Pulsar 18.4 | Biognosys | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | -- |
| R软件（版本4.4.1） | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系：C57BL/6J（GemPharmatech，N000295）或CXCR2flox（上海模式生物，NM-CKO-210198）；饮食：高脂饮食（60% kcal脂肪，MD12033）或正常饮食，喂养20周 阅读提示：Materials and methods: Animals and participants |
| 行为学测试 | von Frey：刺激左后足，每只重复3次取平均值；Hargreaves：辐射热，截止时间20秒；CPA：0.16 g von Frey刺激配对，条件训练3天，每天15分钟 阅读提示：Materials and methods: Von Frey test, Hargreaves test, Conditioned place aversion test |
| 立体定位注射 | PVT坐标：ML -0.25 mm, AP -0.34 mm, DV -3.6 mm；BLA坐标：ML -3.00 mm, AP -1.46 mm, DV -4.7 mm；注射体积100-300 nl，速率30 nl/min，停留5分钟 阅读提示：Materials and methods: Stereotaxic viral injections |
| 化学遗传学操作 | 病毒：AAV-CaMKII-hM4Di-mCherry（PT-0050）或AAV-CaMKII-hM3Dq-mCherry（PT-0049）等；CNO剂量5 mg/kg腹腔注射，实验前30分钟；病毒感染后3周进行实验 阅读提示：Materials and methods: Chemogenetic manipulation |
| 电生理记录 | 脑片厚度300 μm；记录PVTGlu神经元时电流阶跃0-160 pA，步阶20 pA；记录BLAGlu神经元时0-200 pA，步阶10 pA；记录电极电阻3-5 MΩ 阅读提示：Materials and methods: Brain slice electrophysiology |
| 光纤记录 | 病毒：AAV-CaMKII-GCaMP6s（PT-0110）；光纤直径250 μm，植入位置高于注射点0.1 mm；刺激：0.16 g von Frey刺激，信号分析窗口：PVT 25秒，BLA 15秒 阅读提示：Materials and methods: In vivo Ca2+ signal recordings |
| 免疫荧光 | 一抗浓度：抗CaMKII 1:500，抗CXCL7 1:500，抗CXCR2 1:500等；切片厚度40 μm（c-Fos）或10 μm（FISH）；封片剂含DAPI 阅读提示：Materials and methods: Immunofluorescence staining |
| 药理实验 | CXCL7蛋白（HY-P75698）溶于ACSF，侧脑室注射1 μl（50 ng/μl），PVT注射300 nl（50 ng/μl），每天一次连续3天；导管植入后7天开始注射 阅读提示：Materials and methods: Cannula infusion in pharmacological experiment |
| 蛋白质组学 | 血浆样本来自肥胖患者和健康对照；LC-MS/MS使用timsTOF Pro质谱仪；差异蛋白标准：校正P<0.05，FC>1.2或<1/1.2 阅读提示：Materials and methods: Plasma proteomics analysis by LC-MS/MS |