微流体黏附实验
评估CFTR抑制对单核细胞在生理剪切流下黏附的影响
将人外周血单核细胞与CFTR抑制剂或DMSO孵育后，灌注到包被P-selectin和ICAM-1的微流体通道中，在CCL2刺激下观察滚动和黏附行为。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
CFTR通过促进整合素聚集而非激活来决定单核细胞黏附
CFTR dictates monocyte adhesion by facilitating integrin clustering but not activation
实验完整度
高包含体外微流体黏附实验、小鼠模型、超分辨STORM成像、流式细胞术、共免疫沉淀等，形成多层级功能与机制验证。
主要模型
人外周血单核细胞 小鼠骨髓单核细胞 CFTRΔF508小鼠模型 人β2整合素敲入小鼠模型
重点核对
CFTR抑制剂的浓度（10 μM和50 μM）及处理时间 CCL2刺激浓度（小鼠：100 ng/mL和200 ng/mL；人：100 ng/mL） 剪切应力条件（6 dyn cm−2） 微流体通道表面功能化（P-selectin和ICAM-1涂覆） 整合素激活检测抗体（mAb24和KIM127）的使用
摘要
单核细胞在控制组织感染和炎症中至关重要。单核细胞功能障碍导致由CFTR突变引起的囊性纤维化（CF）的炎症发病机制，使得CF成为研究单核细胞对炎症贡献的临床相关疾病模型。尽管CF单核细胞表现出黏附缺陷，但其确切机制尚不清楚。在此，超分辨显微镜显示，整合素聚集缺陷而非整合素激活缺陷决定了CFTR缺陷单核细胞中的黏附缺陷，挑战了现有强调CF患者单核细胞整合素激活缺陷的范式。我们进一步发现，聚集缺陷伴随着CORO1A膜招募、肌动蛋白皮层形成以及CORO1A与整合素结合的缺陷。补充了聚焦于整合素激活的白细胞黏附经典研究，我们强调了整合素聚集在细胞黏附中的重要性，并报告整合素聚集和激活受到不同调控，值得进一步研究以在涉及白细胞依赖性炎症的治疗策略中进行选择性靶向。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CFTR缺陷导致单核细胞黏附缺陷的精确机制是什么？
- 核心机制
- CFTR缺陷通过损害CORO1A的膜招募和肌动蛋白皮层形成，进而影响CORO1A与β2整合素的结合，最终导致β2整合素聚集缺陷，而整合素激活不受影响。
- 主要证据
- CFTR抑制或缺陷的单核细胞在剪切流下黏附减少；β2整合素激活（mAb24/KIM127结合）不受影响；超分辨STORM显示β2整合素聚集减少；CORO1A和F-actin膜招募及与CD18的共定位均受损。
- 研究意义
- 该研究首次证明整合素聚集和激活是独立调控的过程，为治疗白细胞依赖性炎症提供了新的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
整合素激活检测
确定CFTR缺陷是否影响β2整合素的激活构象变化
通过流式细胞术和STORM成像，使用构象特异性抗体mAb24（H+）和KIM127（E+）检测CCL2刺激下单核细胞表面β2整合素的激活状态。
整合素聚集检测
检测CFTR缺陷是否导致β2整合素聚集缺陷
通过STORM成像和多种聚类算法（Voronoi, DBSCAN, K-Ripley）分析单核细胞表面β2整合素的聚集情况。
CORO1A膜招募和肌动蛋白皮层形成检测
探究CFTR缺陷是否影响CORO1A膜定位和肌动蛋白皮层形成
使用去卷积增强的高分辨率荧光显微镜观察CCL2刺激后CORO1A和F-actin在单核细胞中的分布，并进行定量分析。
CORO1A与β2整合素结合检测
验证CFTR缺陷是否影响CORO1A与β2整合素的相互作用
通过双色STORM共定位分析和共免疫沉淀评估CORO1A与CD18的结合情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | EasySep小鼠单核细胞分离试剂盒 | -- | -- |
| EasySep人单核细胞富集试剂盒 | -- | -- | |
| Ficoll | -- | -- | |
| 细胞培养与处理 | CFTR抑制剂-172 | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 细胞处理 | CCL2 | -- | -- |
| 流式细胞术 | mAb24 | -- | -- |
| KIM127 | -- | -- | |
| STORM成像 | SAFe Light模块 | Abbelight | -- |
| sCMOS融合相机 | Hamamatsu | -- | |
| iX83奥林巴斯倒置显微镜 | Olympus | -- | |
| NEO分析软件 | Abbelight | -- | |
| 荧光成像 | AF647偶联二抗 | -- | -- |
| AF568偶联鬼笔环肽 | -- | -- | |
| 蛋白免疫印迹 | ImageQuant LAS 4000 | GE | -- |
| 流式细胞术 | Fluo-4 AM | -- | -- |
| SBFI AM | -- | -- | |
| SYTOX AADvanced | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单核细胞分离 | 小鼠骨髓单核细胞分离（EasySep试剂盒），人外周血单核细胞分离（Ficoll梯度离心和EasySep富集） 阅读提示：Methods: Monocyte Isolation |
| 微流体黏附实验 | 通道包被P-selectin和ICAM-1；剪切应力6 dyn cm−2；CCL2刺激；CFTR抑制剂浓度及处理时间 阅读提示：Methods: Microfluidic Perfusion Assay, Fig. 1 |
| 整合素激活检测 | 抗体：mAb24和KIM127；CCL2浓度；小鼠基因型（人β2整合素敲入与CFTRΔF508杂交）；流式细胞术设置 阅读提示：Methods: Flow Cytometry, Fig. 2 |
| STORM成像分析整合素聚集 | 抗体（AF647-抗CD18、mAb24、KIM127）；刺激条件；悬浮状态；聚类分析算法（Voronoi, DBSCAN, K-Ripley） 阅读提示：Methods: β2 Integrin Clustering by STORM, Fig. 3 |
| CORO1A和肌动蛋白成像 | 抗体（抗CORO1A、鬼笔环肽）；CCL2浓度；去卷积处理 阅读提示：Methods: CORO1A Membrane Recruitment and Actin Cortex Imaging, Fig. 4 |
| 共定位和相互作用检测 | 双色STORM标记；CBC分析；共免疫沉淀步骤 阅读提示：Methods: Coimmunoprecipitation and Western Blot, Colocalization Assays, Fig. 5, Fig. 6 |