细针穿刺活检及积液样本中的多重冷冻免疫染色:初步结果

Multiplex Cryoimmunostaining in Fine-Needle Aspiration Biopsies and Effusion Samples: Preliminary Results

作者信息Simona Miceska, Ivana Kholová, Veronika Kloboves Prevodnik
PMID41662305
发布时间2026-02-09
DOI10.1159/000550736

实验完整度

研究包括临床样本的mCryo与ICC对比验证,涉及多标记物检测和统计学分析,但缺乏功能或机制验证,且样本量有限,属于初步方法评估。

主要模型

细针穿刺活检样本 积液样本 细胞离心涂片

重点核对

样本类型包括21例癌、8例淋巴瘤、5例黑色素瘤和8例非肿瘤性样本 mCryo染色使用7种抗体组合(EpCAM、CK7、CD56、TTF-1、p40、CD45、Calretinin)及DAPI ICC染色作为参考对照,使用不同克隆的抗体 样本在采集后72小时内处理,甲醇固定,储存不超过1周 使用X-ZELL cryofixator和cryostainer进行mCryo染色,ICC用BenchMark Ultra自动染色机

摘要

引言 细胞离心涂片和细胞块上的免疫细胞化学(ICC)通常限于每张载玻片一个标记物,当样本细胞量低时,往往限制诊断准确性。多重冷冻免疫染色(mCryo)虽然在常规细胞病理学实践中尚未使用,但可能有助于克服这些限制。我们的研究评估了mCryo与常规制备的细胞离心涂片上的标准ICC相比的适用性。 方法 使用来自不同疾病的残余细针穿刺活检和积液样本。在甲醇固定的细胞离心涂片上测试了包含EpCAM、CK7、CD56、TTF-1、p40、CD45和钙网蛋白(X-ZELL,新加坡)的抗体组合的mCryo染色,相应的ICC染色细胞离心涂片作为对照。所有载玻片均盲法审查。 结果 分析纳入四十二份样本(21例癌,8例淋巴瘤,5例黑色素瘤,8例非肿瘤性)。mCryo在大多数病例中显示形态保存完好且无背景染色。在癌中,EpCAM(21/21)、CK7(21/21)、p40(3/3)和TTF-1(1/1)观察到100%的真阳性,与ICC结果匹配。TTF-1在2/2良性甲状腺结节样本中也为真阳性。CD45在两种方法的所有样本中均被检测到,标记淋巴细胞。钙网蛋白仅在2/6积液样本中为真阳性。mCryo在全部黑色素瘤(5/5)中意外检测到CK7阳性,而ICC未检测到。此外,mCryo在所有癌和黑色素瘤中CD56也为阳性(26/26),而ICC仅有9例阳性,引发了对非特异性染色、抗体交叉反应或荧光团光谱重叠的疑问。 结论 mCryo能够在常规制备的细胞离心涂片上同时评估每张载玻片上的多个标记物,为低细胞量样本提供潜在的诊断优势。然而,进一步的方法和组合改进以及验证对于准确实施到常规实践中至关重要。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
评估多重冷冻免疫染色(mCryo)在常规制备的细胞离心涂片上的适用性和准确性,并与常规免疫细胞化学(ICC)进行比较。
核心机制
文中未明确说明
主要证据
42例样本(包括21例癌、8例淋巴瘤、5例黑色素瘤、8例非肿瘤性)的对比研究显示,EpCAM、CK7、p40和TTF-1在癌中与ICC结果一致,但CD56和CK7在黑色素瘤中mCryo阳性而ICC阴性,提示可能存在非特异性染色或交叉反应。
研究意义
mCryo为低细胞量样本的多种标记物同时评估提供潜在优势,但需进一步改进和验证以获得准确的诊断应用。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

样本收集与制备

使用残余的细针穿刺活检和积液样本,模拟常规细胞病理学实验室工作流程

从癌症中心常规细胞病理学实验室收集42例样本,包括癌、淋巴瘤、黑色素瘤和非肿瘤性疾病。样本收集后72小时内处理,使用标准实验室方案制备细胞离心涂片,甲醇固定并储存。

2

mCryo染色

测试X-ZELL mCryo平台在细胞离心涂片上同时检测多种标记物的能力

使用X-ZELL cryofixator和cryostainer按照制造商说明进行冷冻固定和冷冻染色。抗体组合包括EpCAM、CK7、CD56、TTF-1、p40、CD45和Calretinin,以及DAPI核染色。

3

ICC参考染色

作为参考对照,验证mCryo染色的准确性

对相同样本的细胞离心涂片进行常规ICC染色,使用不同克隆的抗体在BenchMark Ultra自动染色机上用OptiView检测试剂盒进行。

4

染色结果评估与比较

评估mCryo和ICC染色的特异性和敏感性,并比较两种方法的结果

mCryo染色结果由经过X-ZELL培训的生物医学分析师评估,ICC染色结果由经验丰富的细胞病理学家评估。评估参数包括阳性细胞百分比、染色特异性、背景染色和细胞形态。使用Cronbach's α和Wilcoxon检验进行统计分析。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Superfrost Plus粘附载玻片Epredia--
Shandon细胞离心机Epredia--
冷冻固定仪X-ZELL--
冷冻染色仪X-ZELL--
抗EpCAM抗体Abcam--
抗CK7抗体Abcam--
抗CD56抗体BD Bioscience--
抗TTF1抗体Miltenyi Biotec--
抗p40抗体Abcam--
抗CD45抗体EXBIO--
抗钙网蛋白抗体Santa Cruz--
DAPIBioLegend--
X-ZELL混合显微镜-型号XZHMAX-ZELL--
BenchMark Ultra免疫染色仪Ventana--
OptiView检测试剂盒Ventana--
抗CD56抗体DakoM730401-2
抗CK7抗体DakoM701801
抗TTF1抗体Leica BiosystemsNCL-L-TTF-1
抗EpCAM抗体DakoM3525
抗CD45抗体DakoM070101-2
抗p40抗体ZytomedMSK097
抗钙网蛋白抗体Ventana790-4467
NanoZoomer S360数字切片扫描仪Hamamatsu Photonics--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样本收集与处理
样本类型包括FNAB和积液,收集后72小时内处理,使用含4.5%牛血清白蛋白和0.45% EDTA的介质
阅读提示:Methods: Patients and Samples
细胞离心涂片制备
使用Superfrost Plus载玻片和Shandon cytocentrifuge,离心条件为700 rpm,4分钟
阅读提示:Methods: Cytospin Preparation, Fig. 1a
mCryo染色
冷冻固定缓冲液I(90%甲醇,0.6mM CaCl2,0.4mM MgCl2)和缓冲液II(1× PBS),孵育条件为−25°C 15分钟和−1.5°C 20分钟
阅读提示:Methods: Cryofixation
mCryo染色
抗体孵育条件:封闭45分钟,抗体55分钟,均在−1.0°C
阅读提示:Methods: Multiplex Cryoimmunostaining
ICC参考染色
使用BenchMark Ultra免疫染色仪和OptiView检测试剂盒,DAB作为色原
阅读提示:Methods: Immunocytochemical Staining