TurboID邻近标记蛋白质组学鉴定癌蛋白相互作用组
在原代小鼠造血细胞中全面鉴定三种AML癌融合蛋白的相互作用蛋白，以发现不同机制。
将TurboID融合到PML::RARA、RUNX1::RUNX1T1、CBFB::MYH11或CBFB等蛋白，转导至原代小鼠HSPCs，生物素标记后裂解，链霉亲和素富集，质谱鉴定。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
蛋白质基因组学分析揭示RUNX1被急性髓系白血病起始CBFB::MYH11癌蛋白胞质隔离
Proteogenomic analysis reveals cytoplasmic sequestration of RUNX1 by the acute myeloid leukemia-initiating CBFB::MYH11 oncofusion protein
实验完整度
高研究包含TurboID邻近标记蛋白质组学、免疫荧光、核质分离、Western blot、RNA-Seq及人类AML样本验证等多个独立证据层级，并进行功能验证（N104A突变）和机制验证。
主要模型
原代小鼠骨髓造血干/祖细胞(HSPC) 原代人类CBFB::MYH11 AML细胞 人类K562细胞系 TCGA及验证队列的人类AML样本
重点核对
小鼠原代HSPCs，C57BL/6J，8-16周龄，经lineage depletion后逆转录病毒转导 TurboID标记：50 μM生物素孵育4小时，然后裂解和链霉亲和素富集 免疫荧光：转导4-7天后观察GFP融合蛋白和RUNX1定位 核质分离：使用Minute Plasma Membrane Protein Isolation and Cell Fractionation Kit (SM-005) RNA-Seq：小鼠转导后第4和第7天，人类TCGA和验证队列
摘要
几种经典染色体易位可产生能启动急性髓系白血病(AML)的癌融合基因。虽然每种易位与独特的特征相关，但其机制仍不清楚。虽然已知每种癌融合蛋白相互作用的蛋白与其作用方式相关，但这些相互作用尚未被系统性定义。为了以非偏见方式解决此问题，我们将混 promiscuous 生物素连接酶(TurboID)与三种预后良好型AML癌融合cDNA(PML::RARA、RUNX1::RUNX1T1和CBFB::MYH11)框内融合，并在原代小鼠造血细胞中鉴定了它们的相互作用蛋白。PML::RARA-和RUNX1::RUNX1T1-TurboID融合蛋白标记了常见和独特的核抑制复合物，暗示其核定位。然而，CBFB::MYH11-TurboID相互作用蛋白主要在胞质中，可能是因为MYH11结构域与几种胞质肌球蛋白相关蛋白相互作用。使用多种方法，我们证明CBFB::MYH11的CBFB结构域将RUNX1隔离在胞质聚集体中；这些发现在原代人类AML细胞中得到证实。矛盾的是，CBFB::MYH11表达与RUNX1/2表达增加相关，提示存在一个感知功能性RUNX1蛋白减少的传感器，以及一个可能试图通过增加RUNX1/2转录来补偿的反馈环路。这些发现可能对AML发病机制具有广泛意义。关键词：肿瘤学，表观遗传学，白血病，蛋白质组学。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 三种预后良好型AML癌融合蛋白(PML::RARA、RUNX1::RUNX1T1和CBFB::MYH11)在原代造血细胞中的相互作用蛋白及其作用机制差异是什么？
- 核心机制
- CBFB::MYH11通过CBFB结构域与RUNX1相互作用，通过MYH11结构域与胞质肌球蛋白相关蛋白相互作用，将RUNX1隔离在胞质聚集体中，从而减少核内CBF转录活性；随后通过一个反馈环路增加RUNX1/2表达，试图补偿功能丧失。
- 主要证据
- TurboID邻近标记和质谱显示CBFB::MYH11的相互作用蛋白主要为胞质蛋白；免疫荧光显示CBFB::MYH11在胞质聚集体中与RUNX1共定位（小鼠和人类AML）；N104A突变体失去与RUNX1的相互作用，RUNX1恢复核定位，且Runx1/2上调消失；TCGA和验证队列分析显示所有AML中RUNX1表达升高、CBFB表达降低。
- 研究意义
- 研究提出CBFB::MYH11通过胞质隔离RUNX1而非招募转录抑制复合物来致病，并发现RUNX1/CBFB表达比例失调可能是AML更普遍的病理特征，为AML发病机制和治疗策略提供新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异蛋白相互作用网络和亚细胞定位分析
比较不同癌蛋白的相互作用网络，推测其亚细胞定位和功能差异。
统计每个癌蛋白的差异相互作用蛋白(DIPs)，进行通路富集分析，发现CBFB::MYH11与胞质肌球蛋白蛋白相互作用，而PML::RARA和RUNX1::RUNX1T1与核抑制复合物相互作用。
验证CBFB::MYH11的胞质定位及RUNX1共定位
直接观察CBFB::MYH11在细胞内的定位及其对RUNX1定位的影响。
在小鼠HSPCs中表达GFP融合蛋白（CBFB-GFP, CBFB::MYH11-GFP, GFP-MYH11），进行免疫荧光观察；在人AML样本中进行MYH11和RUNX1/2/3免疫荧光染色。
核质分离验证CBFB::MYH11的分布
通过生化方法定量CBFB和CBFB::MYH11在核质中的分布。
对原代人CBFB::MYH11 AML样本进行核质分离，Western blot检测CBFB和CBFB::MYH11。
N104A突变分析RUNX相互作用依赖性
确定CBFB::MYH11与RUNX的相互作用是否介导其转录和功能效应。
生成CBFBN104A::MYH11突变体，在HSPCs中表达，检测其与RUNX1的结合、亚细胞定位以及对RUNX1定位和转录的影响。
RNA-Seq分析CBFB::MYH11转录组和RUNX1/2表达
评估CBFB::MYH11表达对总体转录和RUNX1/2表达的影响，并验证反馈环路假说。
在小鼠HSPCs中过表达CBFB::MYH11、CBFBN104A::MYH11或空载体，进行RNA-Seq；分析人类TCGA和独立验证队列的RNA-Seq数据。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| TurboID邻近标记 | TurboID (高活性生物素连接酶) | Addgene | 107171 |
| 细胞培养与转导 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | R&D Systems | -- | |
| 细胞因子 | 干细胞因子 | PeproTech | -- |
| 促血小板生成素 | PeproTech | -- | |
| FMS样酪氨酸激酶3配体 | PeproTech | -- | |
| 白细胞介素-3 | PeproTech | -- | |
| 细胞内标记 | 生物素 | MilliporeSigma | -- |
| 蛋白质富集 | 高容量链霉亲和素树脂珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白质组学 | timsTOF Pro质谱仪 | Bruker Daltonics | -- |
| nano-Elute色谱系统 | Bruker Daltonics | -- | |
| 细胞分离 | 直接谱系细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| autoMACS磁性细胞分选仪 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 转染 | TransIT-LT1转染试剂 | Mirus Bio | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 逆转录病毒转导 | RetroNectin纤连蛋白片段 | Takara | -- |
| 细胞裂解 | 蛋白酶抑制剂混合物 | MilliporeSigma | P8340 |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| 抗TurboID抗体 | Novus | NBP2-59939 | |
| 抗RUNX1抗体 | Novus | NBP1-89105 | |
| 抗MYH11抗体 | Novus | NBP2-66967 | |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 647二抗 | Invitrogen | A27040 | |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor 633二抗 | Invitrogen | A21052 | |
| Prolong Glass抗淬灭封片剂 | Invitrogen | -- | |
| 抗RUNX1/2/3抗体(Alexa Fluor 488偶联) | Abcam | ab199221 | |
| 核质分离 | Minute质膜蛋白分离和细胞组分分离试剂盒 | Invent Biotechnologies | SM-005 |
| 蛋白质印迹 | 抗CBFB抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-56751 |
| 抗lamin A/C抗体 | Cell Signaling Technology | 4777 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | MilliporeSigma | MAB1501 | |
| ProteinSimple Jess蛋白分析系统 | Bio-Techne | -- | |
| RNA提取 | Quick-RNA微量提取试剂盒 | Zymo | -- |
| 细胞培养 | K562细胞系 | ATCC | -- |
| 抑制剂处理 | 二异丙基氟磷酸 | MilliporeSigma | -- |
| 细胞裂解 | NuPAGE LDS上样缓冲液 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TurboID邻近标记 | 小鼠品系、年龄、骨髓细胞分离方法、细胞因子组合（SCF、TPO、FLT3L、IL-3浓度）、细胞培养时间、GFP分选时间、生物素浓度和孵育时间、裂解缓冲液成分、链霉亲和素珠孵育时间和温度、洗涤条件、质谱分析参数。 阅读提示：Methods: TurboID proximity labeling; Figure 1A |
| 免疫荧光 | 转导时间（4-7天）、细胞固定和透化方法、抗体稀释度、共聚焦显微镜设置。 阅读提示：Methods: Murine immunofluorescence; Human immunofluorescence; Figure 4, Figure 5A |
| 核质分离与Western blot | 分离所用试剂盒、缓冲液体积、抗体稀释度、蛋白上样量、核质纯度验证。 阅读提示：Methods: Western blotting; Figure 5, D and E |
| RNA-Seq分析 | 转导后收获时间点（第4和7天）、RNA提取方法、差异表达分析参数（>2倍，FDR<0.05）、人类样本来源和队列组成。 阅读提示：Methods: Murine RNA-Seq; Human RNA-Seq; Figure 7 |